Установка и обслуживание систем загазованности

В процессе работы оборудования, которое в качестве топлива использует природный газ, в воздухе могут создаваться недопустимые концентрации углеводородов, а они, в свою очередь, могут привести к отравлению работающих людей или же к возникновению взрывоопасных условий.

Договора на техническое
обслуживание более чем
с 300 предприяти

Большой
опыт работы

Обученный
и сертифицированный
персонал

Специалисты оснащены
самым технологичным
оборудованием

Наши цены

Узнать стоимость оказания услуги вы можете, обратившись по номеру:

8 (4967) 52-17-44

Причинами появления таких ситуаций могут быть:

• неисправность или неправильная настройка регулятора соотношения «газ-воздух»;
• нарушения в работе горелочного оборудования;
• появление течи через стенки дымоходов и котлов;
• несогласованная работа дымососа и вентилятора;
• не герметичность фланцевых, резьбовых и сварных соединений газопроводов;
• разрушение уплотнений и отдельных элементов газовой запорно-регулирующей арматуры и так далее.

Именно поэтому, исходя из СП 41-108-2004, РД 12-341-00 и ПБ 12-529-03 для предотвращения возникновения аварийных ситуаций, во всех помещениях, которые имеют газоиспользующее оборудование, должна быть установлена система контроля загазованности воздуха.

В наше время для таких целей часто используются сигнализаторы загазованности и различные системы автоматизированного контроля, которые созданы на их базе.

Такая система контроля обеспечивает:

• световую и звуковую сигнализацию в случаях превышения предельной концентрации вредных газов;
• непрерывное измерение концентрации газов в воздухе помещения;
• выдачу сигналов устройства на внешние устройства, на диспетчерский пульт, на информационное табло;
• выдачу специальных сигналов на исполнительное устройство для включения системы вентиляции, на клапан для перекрытия подачи газа.

Системы по контролю содержания газа в воздухе и различные сигнализаторы выпускаются как отечественной промышленностью, так и зарубежной. Контроль индивидуальных котельных зданий практически решен, а вот в промышленной сфере далеко не все так однозначно из-за большого разнообразия объектов. Помещения газифицированных цехов и производственных котельных отличаются высоким насыщением газовым и котельным оборудованием, оно занимает значительные по объем площади. Поэтому система должна обеспечивать управление исполнительными механизмами, непрерывный контроль среды, обработку, сбор и передачу информации на диспетчерский пульт. И тут важным фактором является не только функциональные возможности системы, но также и ее надежность, качество и стоимость.

Заявка на заключение договора

Как мы работаем

Для решения указанных задач ООО «ПРОМГАЗАВТОМАТИКА» производит установку и обслуживание систем контроля загазованности помещений угарным газом, метаном.
Мы производим установку и обслуживание сигнализаторов контроля загазованности таких фирм как Seitron, Belt, Аналитприбор, Саргазком и других.
В объем обслуживания сигнализаторов контроля загазованности входит проверка на срабатывание ПГС (проверочными газовыми смесями) по порогам срабатывания, контроль срабатывания релейных выходов, составление технического Акта.

Если прибор контроля загазованности не прошел периодическую поверку, это еще не повод производить его полную замену. С большой вероятностью проблема состоит в выходе из строя электрохимической или термохоимической ячеек, обусловленном ограниченным сроком их службы или неправильной эксплуатацией прибора.

Специалисты ООО «ПРОМГАЗАВТОМАТИКА» прошли серию обучений и технических консультаций на заводах-изготовителях газоаналитического оборудования, по результатам которых получили право проведения ремонта сигнализаторов загазованности. Так же предлагаем заключить договор на обслуживание газового оборудования.

Какое оборудование мы используем

Поверочные газовые смеси ГСО-ПГС

Взрывозащищенный сенсор SEITRON на природный газ

СТГ-1 — сигнализатор токсичных и горючих газов

Сигнализаторы загазованности природным газом СЗ-1

Сигнализатор загазованности на монооксид углерода (СО)

Отзывы

Выписка из протокола испытаний индикатора утечки газа ФТ-02В1 в производственных условиях на объектах ООО «Газпром трансгаз Ухта» от 26. 12.2013 года:

В процессе эксплуатации отмечены следующие особенности:

> Прибор имеет малые размеры и вес, что является дополнительным удобством в процессе эксплуатации.
> Прибор практичен и прост в управлении.
> По мере приближения к месту утечки газа или удаления от него прибор производит измерение роста или уменьшения показателей. 
> Индикатор не относится к измерительным приборам, поэтому не требует государственной поверки.

Несмотря на вышеперечисленные преимущества, имеются и недостатки:

> При включении течеискателя его прогрев составляет 30 секунд.
> Были случаи ложных срабатываний прибора, причина этих срабатываний пока не выявлена и требует более длительных испытаний. 

Заключение:

Течеискатель является практичным, удобным, экономически эффективным. При надлежащем уходе и ремонте срок службы прибора составляет 10 лет. Для определения надежности необходимы длительные (не менее 1 года) испытания.

Отзыв о измерителе давления газа ФД-09

Отзыв от ОАО «Газ-Сервис»

В процессе эксплуатации выявлены следующие преимущества:

> Прочный металлический корпус с сенсорной клавиатурой.
> Контрастный жидкокристаллический индикатор снабжен подсветкой и не отсвечивает на солнце.

Вместе с тем, присутствует и ряд недостатков:

> Чрезмерная жесткость клавиш при нажатии.
> Невозможность дозарядки аккумулятора без полной его разрядки.

Отзыв от ОАО «Газпром газораспределение»

Преимущества:

> Высокая точность измерений.
> Удобная подсветка индикатора.
> Продолжительный заряд аккумулятора.

В качестве недостатков следует отметить длительный период включения, жесткие трубки, отсутствие смены единиц измерения.

Отзывы о газоанализаторе ФП11.2К

Выписка из протокола испытаний ФП11.2К с оптическим сенсором в производственных условиях на объектах ООО «Газпром трансгаз Ухта» от 25.12.2013 г.:

В процессе эксплуатации отмечены следующие особенности:

> Газоанализатор прост и практичен. Показания не требуют пересчета (сразу выводятся объемные проценты).
> Достаточно продолжительное время эксплуатации прибора без подзарядки аккумулятора.
> Быстрый вывод результатов измерений на дисплей. 
> Быстрое обнуление показаний.
> Поверка 1 раз в 12 месяцев.

Несмотря на вышеперечисленные преимущества, имеются и недостатки:

> Нет возможности замерять пропан. Пересчет данных по метану на пропан (как в СГГ-20) не предусмотрен.
> Непонятно, для чего при поверке используется ПГС (пропан-воздух), ПГС (водород-воздух), если газоанализатор может определять только метан. 
> Отсутствует функция долговременного хранения информации (результатов измерения) и переноса данных на ПК.

Заключение:

Газоанализатор ФП11.2К удобен в эксплуатации, прост в техническом обслуживании. Значительный срок службы – 10 лет.

Отзыв от ОАО «Газ-Сервис»

В ходе эксплуатации выявлены следующие особенности:

> Большой четкий дисплей, который не отсвечивает на солнце. Кроме того, с него удобно считывать информацию.
> Удобное расположение элементов управления, экрана и присоединения газозаборной трубки.
> Возможность измерения широких диапазонов наличия газа в воздушной среде.
> Наличие дополнительного фильтра, который легко заменить.
> Прочный корпус.
> Сохранение результатов произведенных замеров с привязкой во времени и дате замера.
> Наличие порта USB для передачи данных на ПК.

Следует отметить и ряд недостатков:

> Длительное время прогрева устройства.
> Чрезмерная жесткость клавиш при нажатии.
> Невозможность дозарядки аккумулятора без полной его разрядки.

Отзывы о течеискателе ФП12

Выписка из протокола испытаний персонального цифрового течеискателя-сигнализатора ФП-12 в производственных условиях на объектах ООО «Газпром трансгаз Ухта» от 16.12.2013 года

В процессе эксплуатации отмечены следующие особенности:

> Прибор прост и практичен.
> Благодаря встроенному микронасосу происходит забор исследуемого воздуха, что приводит практически к мгновенному анализу и выводу на дисплей результатов отбора.
> С использованием функции «фоновой концентрации» есть возможность отслеживать как приближение к зоне утечки газа, так и удаление от нее.
> Имеется подсветка дисплея.
> С использованием функции 8 диапазонов измерения появляется возможность производить замеры концентрации газа в воздухе в различных условиях (помещение, подвал, колодцы и другие объекты).
> Благодаря выдвижной штанге и гибкой соединительной трубке появляется возможность поиска утечки газа в самых труднодоступных местах (колодцы, трубопроводы).
> Длительное время использования прибора без подзарядки.

Несмотря на вышеперечисленные преимущества, имеются и недостатки:

> При включении течеискателя его прогрев составляет 30 секунд.
> Довольно внушительные габаритные размеры устройства, а также его масса.
> Отверстие для выхода всасываемого в аппарат воздушной смеси находится на задней стенке прибора. При проведении замеров, когда прибор находится на шейном ремешке, верхняя одежда производителя замеров препятствует выходу всасываемого воздуха.

Заключение:

Течеискатель является практичным, удобным, экономически эффективным. При надлежащем уходе и ремонте срок службы прибора составляет 10 лет. Для определения надежности необходимы длительные (не менее 1 года) испытания.

Отзывы о газоанализаторе ФП21

Отзыв от ООО «Газпром трангаз Санкт-Петербург» от 23.10.2013 года:

В процессе эксплуатации отмечены следующие особенности:

> Удобный, малогабаритный, компактный прибор, выполненный в металлическом корпусе.
> Отклонения в замерах концентрации газа укладываются в заявленную погрешность прибора.
> Высокая точность измерения объемной доли пропана и метана в воздухе. 
> Межповерочный интервал 1 год.

В качестве недостатка следует отметить случаи потемнения (заплывания) части цифрового индикатора.

Отзыв от ОАО «Газпром газораспределение»

В процессе эксплуатации выявлены следующие особенности:

> полное соответствие температурного диапазона климату региона.
> легкость и компактность прибора.
> сенсорные кнопки управления.

Вместе с тем, отмечен и ряд недостатков:

> для переключения между анализируемыми газами необходимо безошибочно набирать пароль и разрядность двумя находящимися на приборе кнопками, что занимает большое количество времени.
> недостаточно применение в работе только этого прибора, в нем не предусмотрена принудительная подача газовоздушной смеси для анализа при определении концентрации газа в помещениях через отверстия.

Заключение:

За короткий срок эксплуатации работниками аварийной службы в целом прибор проявил себя с лучшей стороны. Простая и удобная инструкция в паспорте на прибор позволяет применять его лицами с квалификацией рабочего.

Отзывы о газоанализаторе ФП22

Выписка из протокола испытаний персонального цифрового течеискателя-сигнализатора ФП-22 в производственных условиях на объектах ООО «Газпром трансгаз Ухта» от 25.12.2013 года

В процессе эксплуатации отмечены следующие особенности:

> Прибор удобен в управлении и практичен в применении.
> Благодаря встроенному микронасосу происходит забор исследуемого воздуха, что приводит практически к мгновенному анализу и выводу на дисплей результатов отбора.
> С использованием функции «фоновой концентрации» есть возможность отслеживать как приближение к зоне утечки газа, так и удаление от нее.
> Имеется подсветка дисплея.
> С использованием функции 8 диапазонов измерения появляется возможность производить замеры концентрации газа в воздухе в различных условиях (помещение, подвал, колодцы и другие объекты).
> Реализована возможность производить поиск утечек газа в труднодоступных местах с использованием телескопической штанги с гибким шлангом.
> Емкость батареи позволяет использовать прибор длительное время без подзарядки.
> Межповерочный интервал 12 месяцев.

Несмотря на вышеперечисленные преимущества, имеются и недостатки:

> Нет возможности зафиксировать телескопическую штангу при использовании и передвижении по объектам контроля (на ремне или приборе).
> Гибкий шланг на телескопической штанге имеет свойство перегибаться, что приводит к перегрузке встроенного насоса (особенно в месте выхода из прибора).
> Не реализована функция долговременного хранения архива показаний измерения и переноса данных на ПК.

Заключение:

Сигнализатор ФП-22  является практичным, удобным, эргономичным, экономически эффективным. При надлежащем уходе и ремонте срок эксплуатации прибора составляет 10 лет. Для определения надежности необходимы длительные (не менее 1 года) испытания.

Отзыв от ОАО «Газпром газораспределение»

В процессе эксплуатации выявлены следующие достоинства:

> Высокая чувствительность.
> Наличие трех режимов работы (индикатор утечки газа, измерение объемной доли газа, комбинированный режим).
> Межповерочный интервал 12 месяцев.
> Сенсорные кнопки управления.

Несмотря на это, имеются и недостаток в необходимости использовать большое количество смесей для проведения поверки прибора.

Отзывы о газоанализаторе ФП33

Отзыв от ОАО «Газ-Сервис»

В ходе эксплуатации выявлены следующие особенности:

> Одновременный контроль концентрации нескольких газов.
> Прочный металлический корпус во взрывозащищенном исполнении.
> Накопление данных о концентрации каждого измеряемого газа с периодом 3 секунды.
> Привязка показаний к реальному времени и дате.
> Возможность установки двух порогов сигнализации для каждого датчика.
> Наличие программного обеспечения для обработки данных на ПК.
> Самотестирование и отображение информации о неисправностях прибора.
> Обеспечение одновременной цифровой индикации концентрации всех измеряемых компонентов.
> Индикация степени заряда аккумулятора, световая и звуковая сигнализация при его разряде.
> Сигнализация при перегрузке насоса.
> Отображение информации о превышении предела рабочих температур.
> Цветной дисплей.
> Высокая чувствительность.

Следует отметить и некоторые недостатки в работе прибора:

> Чрезмерная жесткость клавиш при нажатии.
> Невозможность дозарядки аккумулятора без полной его разрядки.
> Неудобно присоединен шланг забора проб (отверстие находится в задней части прибора, что мешает передвижению, когда прибор висит на ремне).

2. Отзыв от ОАО «Газпром газораспределение»

В процессе использования выявлены следующие достоинства:

> Возможность одновременного контроля концентрации нескольких газов.
> Высокая точность измерения.
> Межповерочный интервал 12 месяцев.

В качестве недостатков следует указать на небольшой размер экрана, его неудобное месторасположение и необходимость использовать для поверки большое количество смесей.

Отзыв на газоанализаторы ФП 21, ФП11.2К, индикатор утечки газа ФТ-02В1

Отзыв от Печорского линейного производственного управления магистральных газопроводов от 28.01.2014 года

Газоанализаторы ФП 21, ФП11.2К, индикатор утечки газа ФТ-02В1 

Указанные приборы использовались с октября 2013 года на объектах Печорского ЛПУ МГ. В ходе эксплуатации выявлены следующие достоинства:

> все приборы во время эксплуатации работали без сбоев, в том числе и при отрицательных температурах;
> показания табло хорошо читаемы;
> приборы энергономичны, удобны и просты в применении;
> хорошо зарекомендовали себя при работе во взрывоопасных зонах;
> ФТ-02В1 точно определяет утечки газа.

Вместе с тем, присутствует и ряд недостатков:

> газоанализатор ФП 21 имеет аккумулятор довольно малой емкости, при отрицательных температурах происходит быстрый разряд;
> газоанализатор ФП 21 при заряде аккумуляторной батареи издает постоянный высокий звуковой сигнал, приходится заряжать его в помещении, где отсутствует персонал;
> газоанализатор ФП 11.2К не был укомплектован штатным ремнем для переноски прибора;
> все приборы имеют низкую степень зашиты от попадания внутрь внешних твердых предметов (пыли) и от проникновения воды.

Заключение:

Все приборы заслуживают хорошей оценки и могут применяться на объектах ООО «Газпром трансгаз Ухта» после устранения указанных замечаний.

Отзыв на газоанализаторы ФП 10, ФП11.2, ФП 11.2К, ФП 33

Отзыв от ООО «Газпром трансгаз Волгоград» от 25.09.2013 года

Газоанализаторы ФП 10, ФП 11.2, ФП 11.2К, ФП 33 производства НП ОДО «ФАРМЭК» используются с 2007 года и на текущий момент в эксплуатации находятся около 180 штук.

Во время эксплуатации газоанализаторы показали хорошую работу и нормальный срок эксплуатации до проведения ремонта. В работе удобны и практичны, время работы приборов до перезарядки аккумуляторов достаточное. Данные газоанализаторы выделяются по категории цена/качество.

Газоанализаторщик (библиотека)

Тестовые задания для проверки знаний рабочих по профессии: «Газоанализаторщик»

Условные обозначения:

+ правильный ответ

— неправильный ответ

Используемая литература:

1.ПБ 08-624-03;

2. Паспорт газоанализатора СГГ-20, АНКАТ;

3. Инструкция по безопасному ведению работ при разведке и разработке нефтяных, газовых и газоконденсатных месторождений с высоким содержанием сероводорода;

4. ВРД 39-1.10-049-2001. Правила технической эксплуатации конденсатопродуктопроводов.

5. Федеральный закон «О промышленной безопасности опасных производственных объектов» от 20.06.97г. №116- ФЗ

Физико-химические свойства сероводорода:

-бесцветный газ, легче воздуха, без запаха

-газ голубоватого цвета, легче воздуха, с запахом яиц.

+бесцветный газ, тяжелее воздуха, с неприятным запахом тухлых яиц

Кем утверждается график замера концентрации газов и их паров на объекте

-газоспасательной службой

+главным инженером предприятия

-начальником цеха

Назначение, устройство и принцип работы газоанализатора АНКАТ-7631:

-определение содержания сероводорода; измерительное устройство, электрохимическая ячейка, аккумулятор; каталитический

-определение содержания сероводорода; измерительное устройство, электрохимическая ячейка, аккумулятор; термохимический

+определение содержания сероводорода и оксида углерода; измерительное устройство, электрохимическая ячейка, аккумулятор; электрохимический

Назначение, устройство и принцип работы газоанализатора СГГ-20:

+измерение концентрации многокомпонентных смесей горючих газов довзрывоопасных значений в воздухе взрывоопасных пространств; блок аккумуляторов, искрозащита, измерительная плата, ТХД, ЖКИ; термохимический

-измерение концентрации многокомпонентных смесей горючих газов довзрывоопасных значений в воздухе взрывоопасных пространств; блок аккумуляторов, искрозащита, измерительная плата, ТХД, ЖКИ; каталитический

-измерение концентрации многокомпонентных смесей горючих газов довзрывоопасных значений в воздухе взрывоопасных пространств; блок аккумуляторов, искрозащита, измерительная плата, ТХД, ЖКИ; электрохимический

Физический смысл ПДК:

+ПДК- предельно допустимая концентрация газов, при превышении которой может произойти отравление человека;

-ПДК- предельно допустимая концентрация газов, при которой может произойти отравление человека;

-ПДК- концентрация газов, при которой не может произойти отравление человека;

Пределы взрываемости метана:

+ (5 – 15.4) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (2.3 – 9.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (3.2 – 12.4) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

Пределы взрываемости этана:

— (5 – 15) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (2.3 – 9.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

+ (3.2 – 12.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

Пределы взрываемости пропана:

— (5 – 15) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

+ (2.0 – 9.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (3.2 – 12.4) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

Пределы взрываемости углеводородов:

+ (1 – 18) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (3.2 – 12.4) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (4.3 – 45.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

Пределы взрываемости сероводорода:

— (1 – 18) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

— (3.2 – 12.4) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

+ (4.3 – 45.5) % объёмной доли в воздухе взрывоопасных пространств

Какая единица измерения используется в сигнализаторе СГГ-20

— мг/литр

— мг/м3

+ % НКПР

Какая единица измерения используется в сигнализаторе АНКАТ

— мг/литр

+ мг/м3 

— % НКПР

Сколько порогов срабатывания звуковой и световой сигнализации в анализаторе АНКАТ

— один

+ два

— три

Заряжать аккумуляторную батарею во взрывоопасной среде:

-разрешается

+запрещается

-разрешается при температуре окружающей среды от 15 до 35 градусов С

На каком расстоянии от сигнализатора СГГ-20 запрещается работать с сотовым телефоном

-ближе 10 см

-ближе 20 см

+ближе 30 см

Какое количество времени необходимо для зарядки аккумуляторов сигнализатора СГГ-20

-8 часов

-16 часов

+18 – 22 часа

Какое количество времени необходимо для зарядки аккумулятора анализатора АНКАТ

-8 часов

+16 часов

-18 – 22 часа

Какое количество времени может работать непрерывно без подзарядки аккумулятора анализатор АНКАТ

-8 часов

-16 часов

+24 часа

Какое количество времени может работать непрерывно без подзарядки аккумулятора сигнализатор СГГ-20 при плюсовых (минусовых) температурах

+9 часов (2 часа)

-16 часов (4 часа)

-24 часа (6 часов)

Как часто проводится госповерка пригодности сигнализаторов СГГ-20 и АНКАТ-7631

-1 раз в 3 месяца

-1 раз в 6 месяцев

+1 раз в 12 месяцев

Что означает сообщение АВАРИЯ, выводимое на ЖКИ сигнализатора СГГ-20

+сгорели чувствительные элементы или кабель, а также неправильную установку значений порогов

-сгорели чувствительные элементы или кабель

-неправильная установка значений порогов

Какая формула используется  для перевода значения молекулярной массы в весовую концентрацию

-Св = (22,4)/М10

-Св = (М22,4)/10

+Св = (М10)/22,4

Что означает срабатывание значения порога «ПОРОГ-1» на сигнализаторе СГГ-4М

+достижение значения концентрации газа предупредительной величины

-достижение значения концентрации газа аварийной величины

-достижение значения концентрации газа взрывоопасной величины

Что означает срабатывание значения порога «ПОРОГ-2» на сигнализаторе СГГ-4М

+ достижение значения концентрации газа аварийной величины

— достижение значения концентрации газа предупредительной величины

— достижение значения концентрации газа взрывоопасной величины

Какие меры должен принять обслуживающий персонал при срабатывании сигнализации «ПОРОГ-1» и «ПОРОГ-2» на сигнализаторе СГГ-20

+меры по устранению повышенной загазованности в соответствии с ПЛВА

— меры по защите органов дыхания обслуживающего персонала

— меры по защите обслуживающего персонала от взрыва

Что означает единица измерения концентрации газа %НКПР на сигнализаторах СГГ

+процент от нижнего концентрационного предела распространения пламени газа

-процент от концентрации самовоспламенения газа

-процент от предельно-допустимой взрыво-безопасносной концентрации газа

Что необходимо предпринять в случае обнаружения загазованности воздуха рабочей зоны (п.3.5.4.12) ПНГП

-Незамедлительно подать сигнал тревоги и предупредить ответственного руководителя.

-Незамедлительно предупредить обслуживающий персонал и покинуть загазованный участок.

-Незамедлительно покинуть загазованный участок и информировать о случившемся ответственного руководителя.

-Незамедлительно предупредить обслуживающий персонал о возможной опасности.

+ Незамедлительно предупредить обслуживающий персонал близлежащих установок о возможной опасности, оградить загазованный участок и принять меры по устранению источника загазованности.

Какие меры необходимо предпринять при обнаружении в замкнутом пространстве паров легковоспламеняющихся жидкостей или газов (п.3.6.24) ПНГП

-Проветрить замкнутое пространство с помощью механической системы принудительной вентиляции.

+  Работы должны быть немедленно прекращены.

-Проветрить замкнутое пространство путем открытие люков с противоположных сторон замкнутого пространства.

-Работы продолжить после извещения руководителя работ.

-Провести анализ обнаруженных паров и газов.

В какие сроки проверяется в соответствии с графиком, утвержденным техническим руководителем организации, наличие и состояние аварийного запаса фильтрующих противогазов (п.3.8.14) ПНГП

-Ежесменно.

-Раз в неделю.

+ Не реже одного раза в месяц.

-Не реже одного раза в пол года.

-Не реже одного раза в год.

Рабочие могут быть допущены к газоопасным работам только после: (п.3.8.19)  ПНГП

+ Проведения соответствующего инструктажа.

+ Получения наряда-допуска.

+ Получения плана ведения газоопасных работ, утвержденного начальником установки.

Какое количество людей для подстраховки на случай аварийной ситуации должно находиться снаружи у входа или выхода при работе в замкнутом пространстве (п.3.6.20) ПНГП

-Один наблюдающий.

+  Не менее двух наблюдающих.

-Один наблюдающий и руководитель работ.

-Два наблюдающих и руководитель работ.

-Три наблюдающих, один из которых- ответственный за выполнение работ.

Что должны осуществлять находящиеся снаружи наблюдающие (п.3.6.21) ПНГП

-Поддерживать постоянную связь с лицами, работающими в замкнутом пространстве.

-Следить за правильным положением шланга шлангового противогаза и заборного патрубка.

-Держать в готовности дыхательные аппараты.

-Все перечисленное.

+  Следить за временем нахождения работающего в замкнутом пространстве и правильным положением шланга шлангового противогаза и заборного патрубка.

В каких случаях применяются противогазы с принудительной подачей воздуха (п.3.8.24) ПНГП

+  При необходимости применять шланги длиной более 10 м.

-При необходимости применять шланги длиной более 8 м.

-При необходимости применять шланги длиной более 6 м.

-При необходимости применять шланги длиной более 5 м.

-При необходимости применять шланги длиной более 4 м.

Каков срок единовременного пребывания рабочего в шланговом противогазе (п.3.8.25) ПНГП

-20 минут с последующим отдыхом не менее 10 минут.

+30 минут с последующим отдыхом не менее 15 минут.

-40 минут с последующим отдыхом не менее 15 минут.

-45 минут с последующим отдыхом не менее 20 минут.

-Один час с последующим отдыхом не менее 20 минут.

В местах проведения газоопасных работ должен быть: (п.3.8.29) ПНГП

+  Резервный комплект шлангового противогаза.

—   Резервный комплект спецодежды.

—   Резервный комплект защитных очков.

—   Резервный комплект резиновых перчаток.

—   Резервный комплект резиновых ботов.

Какой размер шлем маски №4 4: (п.1.3.7.).

-95-99см.

-93-95см. 

-99-103 см.

+Свыше 103 см.

Какова смертельная концентрация сероводорода 4: (п.1.1.7.).

-100мг/м3

+  1000мг/м3 

-10 мг/м3

-200- 280мг/м3

Чему равна ПДК сероводорода рабочей зоны 4: (п.1.1.9.).

-100мг/м3

-3мг/м3 

+  10 мг/м3

-0,008 мг/м3.

Чему равна ПДК сероводорода рабочей зоны в смеси с углеводородами 4: (п.1.1.9.).

-100мг/м3

+  3мг/м3

-10 мг/м3

-0,008 мг/м3

Чему равна ПДК сероводорода в жилых районах 4: (п.1.1.9.).

-100мг/м3

-3мг/м3

-10 мг/м3

+ 0,008 мг/м3

Первое действие при повышенной загазованности: (4: п.3.10.)

-Сообщить руководству

-Выйти из загазованной зоны

-Оказать первую помощь пострадавшему

+  Одеть противогаз

Как будете выходить из загазованной зоны Укажите универсальный ответ. (4: п.3.4.)

-Против ветра

+ Перпендикулярно направлению ветра

-Быстрыми шагами с перебежками

-По указателю

Каким огнетушителем нельзя пользовать при загорании электрооборудования (Инструкции к огнетушителям)

+ Пенным

— Углекислотным

— Порошковым

Тушить человека  любым огнетушителем  разрешается или запрещается (Инструкции к огнетушителям)

— разрешается

+ запрещается

При определении загазованности в помещении пробы воздуха берут:

—  в 3 точках

—  в 10 точках

+  по схеме

При определении загазованности в колодце пробы воздуха берут:

+ в 3 точках

—  в 10 точках

—  по схеме

При определении загазованности в резервуаре пробы воздуха берут:

—  в 3 точках

+ в 10 точках

—  по схеме

При определении загазованности в котельной пробы воздуха берут:

—  в 3 точках

—  в 10 точках

+ по схеме

Горение – это

— тепловой процесс

+ реакция окисления

— разложение вещества

Взрыв – это

— тепловой процесс

— реакция окисления

— процесс горения

+ освобождение большого количества энергии в ограниченном объёме за короткий промежуток времени

Средства индивидуальной защиты от действия сероводорода

— марлевая повязка

+ противогаз

— теплое питье

К колориметрическим газоанализаторам относятся

— СГГ-4, СГГ-20, КОЛЕОН

— АНКАТ-7631

+ УГ-2, ГХ-4

К термохимическим газоанализаторам относятся

+ СГГ-4, СГГ-20,

— АНКАТ-7631

— УГ-2, ГХ-4

К электрохимическим газоанализаторам относятся

— СГГ-4, СГГ-20

+ АНКАТ-7631

— УГ-2, ГХ-4

Величина НКПР метана равна

— 40% от нижнего предела взрываемости метана

— 60% от нижнего предела взрываемости метана

+ 80% от нижнего предела взрываемости метана

Огнеопасные работы прекращаются при загазованности

+ 20% от нижнего предела взрываемости

— 40% от нижнего предела взрываемости

— 60% от нижнего предела взрываемости

Газоанализатор СГГ- 3У применяется для определения концентрации

— весовой

+ объемной

— газовой

Газоанализатор СГГ- 4М применяется для определения концентрации

— весовой

+ объемной

— газовой

Газоанализатор СГГ- 20 применяется для определения концентрации

— весовой

+ объемной

— газовой

Газоанализатор АНКАТ 7621 (Н2S)  применяется для определения концентрации

+ весовой

— объемной

— газовой

Газоанализатор АНКАТ (О2) применяется для определения концентрации кислорода

— весовой

+ объемной

— газовой

Газоанализатор СГГ-4М настраивается на срабатывание ПОРОГ 1 концентрацией газа

— 7% НКПР

+ 10% НКПР

— 12% НКПР

Газоанализатор СГГ-20 настраивается на срабатывание ПОРОГ 1 концентрацией газа

+ 7% НКПР

— 10% НКПР

— 12% НКПР

Газоанализатор СГГ-4М настраивается на срабатывание ПОРОГ 2 концентрацией газа

— 7% НКПР

— 10% НКПР

+ 12% НКПР

Газоанализатор СГГ-20 настраивается на срабатывание ПОРОГ 2 концентрацией газа

— 7% НКПР

— 10% НКПР

+ 12% НКПР

Какой газоанализатор работает на фотометрическом эффекте

— АНКАТ

+ КОЛЕОН

— СГГ

Контроль воздушной среды в помещениях осуществляется

+ 1 раз в 8 часов

— 1 раз  в 2 часа

— 1 раз в 24 часа

Контроль воздушной среды на открытых установках осуществляется

— 1 раз в 8 часов

— 1 раз  в 2 часа

+ 1 раз в 24 часа

Контроль воздушной среды в аварийных ситуациях осуществляется

— 1 раз в 8 часов

+ 1 раз  в 2 часа

— 1 раз в 24 часа

Контроль воздушной среды в колодцах осуществляется

+ по графику

— 1 раз  в 2 часа

— 1 раз в сутки

При определении загазованности на открытых установках при нормальных условиях используют

+ газоанализаторы

— резиновые камеры

— стеклянные бутыли

При определении загазованности на открытых установках при температуре менее минус 10С градусов  используют

— газоанализаторы

+ резиновые камеры

— стеклянные бутыли

При определении загазованности на открытых установках в дождливое время используют

— газоанализаторы

+ резиновые камеры

— стеклянные бутыли

При ведении огневых работ на открытых установках отбор проб проводить

— каждые 30 мин

+ каждый час

— каждые 2 часа

При ведении огневых работ в помещениях, резервуарах отбор проб проводить

+ каждые 30 мин

— каждый час

— каждые 2 часа

При выполнении газоопасных и огневых работ показания заносятся

— в журнал

+ в наряд-допуск

— на бланки

Показания загазованности, снимаемые по графику, заносятся

+ в журнал

— наряд-допуск

— на бланки

Показания загазованности, снимаемые по графику на открытых установках заносятся

— в журнал

— в наряд-допуск

+ на бланки

В труднодоступных местах загазованность определяется с помощью

— спущенного газоанализатора

+ заборной трубки

— специального насоса

В резиновую камеру воздух забирается из

— газоанализатора

— заборной трубки

+ специального насоса

При использовании заборной трубки воздух подается на активную ячейку газоанализатора с помощью

+ резиновой груши

— конвекционно

— специального насоса

Подача воздуха при обычных условиях на термохимическую ячейку производится

— резиновой грушей

+ конвекционно

— специальным насосом

Газоанализатор АНКАТ срабатывает на концентрацию сероводорода ( Н2S )

+ 3мг/куб.м

— 10мг/куб.м

— 30мг/куб.м

Газоанализатор АНКАТ-7631 применяется для определения концентрации

+ сероводорода

— кислорода

— углеводородов

Газоанализатор АНКАТ-7641 применяется для определения концентрации

— сероводорода

+ кислорода

— углеводородов

Газоанализатор СГГ-4М применяется для определения концентрации

— сероводорода

— кислорода

+ углеводородов

Газоанализатор СГГ-20 применяется для определения концентрации

— сероводорода

— кислорода

+ углеводородов

Газоанализатор КОЛЕОН применяется для определения концентрации

— сероводорода

— углеводородов

+ различных газов

Каким огнетушителем можно тушить ЛВЖ (Инструкции к огнетушителям)

+ пенным

+ углекислотным

+ порошковым

Чем опасны пирофорные отложения (5: стр.266, 3 абз.)

-они очень токсичны.

-они взрывоопасны.

+  они способны самовозгораться.

-они обладают неприятным запахом.

Назовите ПДК для углеводородов нефти (К:, стр. 254, 3 абз. снизу)

-10 мг/м3

-100 мг/м3

+  300 мг/м3

-350 мг/м3

Назовите марку противогаза и отличительную окраску фильтрующей коробки для защиты от паров органического вещества. (К: стр.272, таблица 19)

+  марка А, коробка коричневая

—  марка М, коробка красная

—  марка В, коробка желтая

—  марка КД, коробка серая

От каких газов применяются фильтрующие противогазы марки КД  (К:, стр. 272, табл.19)

-кислых газов, сернистого газа

+  сероводорода и аммиака

-всех газов

-сероводорода и сернистого газа

Чему соответствует нижний предел взрываемости (К:, стр. 268, 2 абз.)

+ нижний предел взрываемости соответствует минимальной концентрации паров горючего в смеси с     воздухом,  при которой происходит вспышка при поднесении пламени

-нижний предел взрываемости соответствует минимальной концентрации паров горючего в смеси с воздухом, выше которой вспышки уже не происходит, из-за недостатка кислорода воздуха

-нижний предел взрываемости соответствует минимальной концентрации паров горючего в смеси с воздухом, при которой вспышка происходит самопроизвольно

-нижний предел взрываемости соответствует минимальной концентрации паров горючего в смеси с воздухом,  выше которой вспышки уже не происходит из-за избытка кислорода воздуха

Шланговые противогазы проверяют на герметичность перед выполнением работ (ПБ 12-529-03, 10.56):

—  внешним осмотром;

+  зажатием конца гофрированной дыхательной трубки

—  внутренним осмотром

—  любым удобным методом;

Дайте определение термину  «авария» (Федеральный закон № 116 от 1997 года «О промышленной безопасности опасных производственных объектов» ст.1):

+ разрушение сооружений и (или) технических устройств, применяемых на опасном производственном объекте, неконтролируемый взрыв и (или) выброс опасных веществ;

— контролируемое и (или) неконтролируемое горение, а также взрыв на опасных производственных объектов;

— нарушение целостности или полное разрушение сооружений и технических устройств опасных производственных объектов при отсутствии взрыва, либо выброса опасных веществ;

Дайте определение термину  «инцидент» (Федеральный закон № 116 от 1997 года «О промышленной безопасности опасных производственных объектов» ст.1):

— разрушение сооружений и (или) технических устройств, применяемых на опасном производственном объекте, неконтролируемый взрыв и (или) выброс опасных веществ;

— контролируемое и (или) неконтролируемое горение, а также взрыв на опасных производственных объектов;

+ отказ или повреждение технических устройств, применяемых на опасном производственном объекте, отклонение от режима технологического процесса, нарушение положений Федерального закона № 116-ФЗ, других федеральных законов и иных нормативных правовых актов РФ, а также нормативных технических документов, устанавливающих правила ведения работ на опасном производственном объекте;

РКС Компоненты — РАДИОМАГ

НОВОСТИ

Полный список  смотрите  по ссылке.

02/04/2021

Контроллер температуры и влажности, Тестер емкости аккумулятора, Тестер полупроводников, Компактный усилитель мощности, 

02/04/2021

Пополнение склада и расширение ассортимента от производителя Hantek Electronics.

01/04/2021

Пополнение склада и расширение ассортимента от производителя LiitoKala.

01/04/2021

В связи с введением усиленного карантина.

в г. Львов с 19.03.2021

18/03/2021

Расширен ассортимент радиомодулей с интерфейсами: UART, UART/IO, IO,  USB, SPI.

Полный список поставки по ссылке HOPE RF

26/11/2020

Паяльное оборудование производителей YIHUA и AOYUE на складе, а также в сети магазинов РАДИОМАГ

На нашем складе обновился ассортимент таких товарных групп как: паяльные станции, паяльники, фены, жала, насадки на фен, уловитель дыма.

Полный перечень пополнения смотрите по ссылке, либо в разделе

24/11/2020

Просим обратить внимание.

23/11/2020

Расширен складской запас энкодеров

Перечень поставки смотрите по ссылке либо в разделе сайта.

01/11/2020

Расширен ассортимент радиомодулей с интерфейсами: UART, UART/IO, IO,  USB, SPI, RS232 / RS485.

Полный список поставки по ссылке Ebyte

19/10/2020

Выбираем головной светильник СГГ-10

Взрывозащищенный (РВ) светильник модели СГГ-10 предназначен для освещения площадей, помещений со взрывоопасной средой: нефтегазохимическая, химическая промышленность, шахты, прочие объекты, в которых допускается эксплуатация взрывозащищенного электрооборудования категории IIВ, класс температурный — Т5.

Осветитель марки СГГ10 «эльф» также применяется на предприятиях, занимающихся добычей, переработкой, хранением и перевозкой газа, нефтепереработкой, в ЖКХ, на строительных объектах, в энергетической сфере, связи, на ж/д транспорте, метрострое, на прочих производственных объектах.

В этой статье:

Описание

Светильники СГГ головные оснащены:

• двумя рабочими режимами: основным, аварийным;
• компактным источником питания (зарядным приспособлением), который размещен в корпусе вместе с фарой;
• устройством стабилизации излучаемого потока света;
• индикацией табельного номера, текущего времени, уровня подзарядки аккумулятора;
• защитой против глубокого разряда АКБ;
• специальными ремешками для фиксации прибора освещения на голове рабочего, а также скобами для крепления осветительного устройства на каске.

К сведению! Светильник модели СГГ-10 может беспрерывно работать на полностью заряженной батарее 10 часов.

Дополнительная комплектация изделия под заказ:

Технико-эксплуатационные характеристики

К сведению! Сделать выгодный заказ светильника головного серии СГГ можно через интернет-магазин.

% PDF-1.4 % 1182 0 объект > эндобдж xref 1182 415 0000000016 00000 н. 0000008675 00000 н. 0000008865 00000 н. 0000009020 00000 н. 0000009094 00000 н. 0000012795 00000 п. 0000013321 00000 п. 0000013408 00000 п. 0000013511 00000 п. 0000013603 00000 п. 0000013782 00000 п. 0000013849 00000 п. 0000013988 00000 п. 0000014140 00000 п. 0000014302 00000 п. 0000014369 00000 п. 0000014493 00000 п. 0000014607 00000 п. 0000014768 00000 п. 0000014835 00000 п. 0000014964 00000 п. 0000015122 00000 п. 0000015284 00000 п. 0000015351 00000 п. 0000015464 00000 п. 0000015531 00000 п. 0000015638 00000 п. 0000015804 00000 п. 0000015871 00000 п. 0000015984 00000 п. 0000016095 00000 п. 0000016162 00000 п. 0000016287 00000 п. 0000016354 00000 п. 0000016421 00000 п. 0000016488 00000 п. 0000016644 00000 п. 0000016711 00000 п. 0000016867 00000 п. 0000016990 00000 н. 0000017160 00000 п. 0000017227 00000 п. 0000017372 00000 п. 0000017540 00000 п. 0000017707 00000 п. 0000017774 00000 п. 0000017878 00000 п. 0000017979 00000 п. 0000018156 00000 п. 0000018223 00000 п. 0000018380 00000 п. 0000018447 00000 п. 0000018548 00000 п. 0000018648 00000 п. 0000018715 00000 п. 0000018877 00000 п. 0000018944 00000 п. 0000019047 00000 п. 0000019153 00000 п. 0000019271 00000 п. 0000019338 00000 п. 0000019453 00000 п. 0000019520 00000 п. 0000019633 00000 п. 0000019700 00000 п. 0000019818 00000 п. 0000019885 00000 п. 0000020008 00000 п. 0000020075 00000 п. 0000020142 00000 п. 0000020280 00000 п. 0000020347 00000 п. 0000020472 00000 п. 0000020539 00000 п. 0000020666 00000 п. 0000020733 00000 п. 0000020800 00000 н. 0000020867 00000 п. 0000021012 00000 п. 0000021163 00000 п. 0000021318 00000 п. 0000021385 00000 п. 0000021559 00000 п. 0000021720 00000 н. 0000021886 00000 п. 0000021953 00000 п. 0000022067 00000 п. 0000022189 00000 п. 0000022347 00000 п. 0000022414 00000 п. 0000022526 00000 п. 0000022625 00000 п. 0000022799 00000 н. 0000022866 00000 п. 0000023009 00000 п. 0000023133 00000 п. 0000023240 00000 п. 0000023306 00000 п. 0000023438 00000 п. 0000023504 00000 п. 0000023632 00000 п. 0000023698 00000 п. 0000023822 00000 п. 0000023888 00000 п. 0000023954 00000 п. 0000024021 00000 п. 0000024145 00000 п. 0000024212 00000 п. 0000024344 00000 п. 0000024411 00000 п. 0000024532 00000 п. 0000024599 00000 п. 0000024715 00000 п. 0000024781 00000 п. 0000024847 00000 п. 0000024958 00000 п. 0000025058 00000 п. 0000025124 00000 п. 0000025249 00000 п. 0000025315 00000 п. 0000025381 00000 п. 0000025448 00000 п. 0000025577 00000 п. 0000025644 00000 п. 0000025784 00000 п. 0000025851 00000 п. 0000025918 00000 п. 0000025985 00000 п. 0000026139 00000 п. 0000026206 00000 п. 0000026319 00000 п. 0000026386 00000 п. 0000026528 00000 п. 0000026595 00000 п. 0000026787 00000 п. 0000026854 00000 п. 0000026967 00000 п. 0000027070 00000 п. 0000027243 00000 п. 0000027310 00000 н. 0000027418 00000 п. 0000027524 00000 п. 0000027638 00000 п. 0000027705 00000 п. 0000027837 00000 н. 0000027904 00000 н. 0000028086 00000 п. 0000028153 00000 п. 0000028317 00000 п. 0000028418 00000 п. 0000028577 00000 п. 0000028644 00000 п. 0000028768 00000 п. 0000028884 00000 п. 0000028998 00000 н. 0000029065 00000 н. 0000029132 00000 п. 0000029257 00000 п. 0000029324 00000 п. 0000029391 00000 п. 0000029458 00000 п. 0000029571 00000 п. 0000029638 00000 п. 0000029767 00000 п. 0000029834 00000 п. 0000029901 00000 н. 0000029968 00000 н. 0000030082 00000 п. 0000030149 00000 п. 0000030216 00000 п. 0000030283 00000 п. 0000030406 00000 п. 0000030473 00000 п. 0000030540 00000 п. 0000030607 00000 п. 0000030674 00000 п. 0000030817 00000 п. 0000030923 00000 п. 0000031060 00000 п. 0000031127 00000 п. 0000031307 00000 п. 0000031374 00000 п. 0000031495 00000 п. 0000031631 00000 п. 0000031799 00000 н. 0000031866 00000 п. 0000031971 00000 п. 0000032092 00000 п. 0000032263 00000 п. 0000032330 00000 п. 0000032452 00000 п. 0000032571 00000 п. 0000032638 00000 п. 0000032776 00000 п. 0000032843 00000 п. 0000032981 00000 п. 0000033048 00000 п. 0000033182 00000 п. 0000033249 00000 п. 0000033316 00000 п. 0000033383 00000 п. 0000033450 00000 п. 0000033517 00000 п. 0000033692 00000 п. 0000033759 00000 п. 0000033897 00000 п. 0000033964 00000 п. 0000034107 00000 п. 0000034174 00000 п. 0000034310 00000 п. 0000034377 00000 п. 0000034511 00000 п. 0000034578 00000 п. 0000034645 00000 п. 0000034712 00000 п. 0000034833 00000 п. 0000034900 00000 п. 0000035027 00000 н. 0000035094 00000 п. 0000035161 00000 п. 0000035257 00000 п. 0000035366 00000 п. 0000035433 00000 п. 0000035500 00000 н. 0000035567 00000 п. 0000035634 00000 п. 0000035739 00000 п. 0000035842 00000 п. 0000035909 00000 н. 0000036032 00000 п. 0000036099 00000 п. 0000036223 00000 п. 0000036290 00000 п. 0000036442 00000 п. 0000036509 00000 п. 0000036628 00000 п. 0000036695 00000 п. 0000036835 00000 п. 0000036902 00000 п. 0000037042 00000 п. 0000037109 00000 п. 0000037176 00000 п. 0000037270 00000 п. 0000037383 00000 п. 0000037450 00000 п. 0000037517 00000 п. 0000037584 00000 п. 0000037651 00000 п. 0000037770 00000 п. 0000037837 00000 п. 0000037950 00000 п. 0000038017 00000 п. 0000038135 00000 п. 0000038202 00000 п. 0000038320 00000 п. 0000038387 00000 п. 0000038454 00000 п. 0000038521 00000 п. 0000038626 00000 п. 0000038731 00000 п. 0000038905 00000 п. 0000038972 00000 п. 0000039075 00000 п. 0000039179 00000 п. 0000039314 00000 п. 0000039381 00000 п. 0000039498 00000 п. 0000039565 00000 п. 0000039683 00000 п. 0000039750 00000 п. 0000039871 00000 п. 0000039938 00000 н. 0000040050 00000 п. 0000040117 00000 п. 0000040231 00000 п. 0000040298 00000 н. 0000040416 00000 п. 0000040483 00000 п. 0000040594 00000 п. 0000040661 00000 п. 0000040837 00000 п. 0000040904 00000 п. 0000040995 00000 п. 0000041062 00000 п. 0000041129 00000 п. 0000041196 00000 п. 0000041263 00000 п. 0000041403 00000 п. 0000041470 00000 п. 0000041587 00000 п. 0000041654 00000 п. 0000041774 00000 п. 0000041841 00000 п. 0000041960 00000 п. 0000042027 00000 н. 0000042146 00000 п. 0000042213 00000 п. 0000042347 00000 п. 0000042414 00000 п. 0000042529 00000 п. 0000042596 00000 п. 0000042716 00000 н. 0000042783 00000 п. 0000042850 00000 п. 0000042960 00000 п. 0000043069 00000 п. 0000043136 00000 п. 0000043203 00000 п. 0000043270 00000 п. 0000043337 00000 п. 0000043508 00000 п. 0000043575 00000 п. 0000043692 00000 п. 0000043828 00000 п. 0000044005 00000 п. 0000044072 00000 п. 0000044178 00000 п. 0000044284 00000 п. 0000044446 00000 п. 0000044513 00000 п. 0000044642 00000 п. 0000044751 00000 п. 0000044818 00000 п. 0000044936 00000 п. 0000045003 00000 п. 0000045070 00000 п. 0000045137 00000 п. 0000045204 00000 п. 0000045271 00000 п. 0000045409 00000 п. 0000045476 00000 п. 0000045622 00000 п. 0000045689 00000 п. 0000045854 00000 п. 0000045921 00000 п. 0000045988 00000 п. 0000046106 00000 п. 0000046247 00000 п. 0000046314 00000 п. 0000046381 00000 п. 0000046448 00000 н. 0000046515 00000 п. 0000046621 00000 н. 0000046721 00000 п. 0000046788 00000 п. 0000046855 00000 п. 0000046922 00000 н. 0000046989 00000 п. 0000047123 00000 п. 0000047190 00000 п. 0000047348 00000 п. 0000047415 00000 п. 0000047482 00000 п. 0000047549 00000 п. 0000047656 00000 п. 0000047789 00000 п. 0000047856 00000 п. 0000047973 00000 п. 0000048040 00000 п. 0000048169 00000 п. 0000048236 00000 п. 0000048368 00000 н. 0000048435 00000 п. 0000048556 00000 п. 0000048623 00000 п. 0000048735 00000 п. 0000048802 00000 п. 0000048939 00000 п. 0000049006 00000 п. 0000049158 00000 п. 0000049225 00000 п. 0000049292 00000 п. 0000049406 00000 п. 0000049524 00000 п. 0000049591 00000 п. 0000049658 00000 п. 0000049786 00000 п. 0000049853 00000 п. 0000049995 00000 н. 0000050062 00000 н. 0000050206 00000 п. 0000050273 00000 п. 0000050415 00000 п. 0000050482 00000 п. 0000050621 00000 п. 0000050688 00000 п. 0000050755 00000 п. 0000050820 00000 п. 0000050934 00000 п. 0000051043 00000 п. 0000051074 00000 п. 0000051117 00000 п. 0000051140 00000 п. 0000051862 00000 п. 0000051885 00000 п. 0000052469 00000 п. 0000052492 00000 п. 0000053054 00000 п. 0000053077 00000 п. 0000053559 00000 п. 0000053582 00000 п. 0000054150 00000 п. 0000054173 00000 п. 0000054752 00000 п. 0000054775 00000 п. 0000055523 00000 п. 0000055546 00000 п. 0000055754 00000 п. 0000057234 00000 п. 0000057889 00000 н. 0000057968 00000 п. 0000061072 00000 п. 0000065226 00000 п. 0000009249 00000 н. 0000012771 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 1183 0 объект > эндобдж 1184 0 объект с ߁ mJP ֍ H \)%) / U (o \ (Ntp #% KckWIV ׬ O0) / П-44 / V 1 / Длина 40 >> эндобдж 1185 0 объект > эндобдж 1186 0 объект > / Кодировка> >> / DA (.0O

Нарушение протеомов при разрешении отдельных остатков с использованием редактирования оснований

Введение

Недавние технические достижения позволили исследовать карту генотип-фенотип с высоким разрешением путем экспериментального измерения эффекта всех возможных замен нуклеотидов в короткой последовательности ДНК. Хотя насыщенный мутагенез информирует нас о влиянии многих мутаций, он обычно охватывает один локус или его часть ^{1, 2} . Поскольку такие данные доступны только при достаточном охвате очень небольшого количества белков, общие правила эффектов замещения должны быть экстраполированы на другие, часто не связанные между собой белки.На более низком уровне разрешения данные о мутациях в масштабе генома в основном были получены посредством крупномасштабных коллекций штаммов с потерей функции, где одно и то же генетическое изменение (например, полная делеция гена) применяется ко всем генам ^3–5 . Этот подход является мощным способом изолировать вклад каждого гена в фенотип, включая приспособленность, но ограничивает наше понимание роли конкретных позиций в локусе.

Подходы, основанные на CRISPR-Cas9, обычно вызывают потерю функции белка за счет образования инделей ⁶ или путем изменения уровней экспрессии генов ^7–9 во многих локусах параллельно.Опять же, эти подходы обычно ограничивают получение информации одним возмущением на локус. Следовательно, существует значительный компромисс между разрешением существующих анализов и количеством исследуемых локусов или генов. Недавние разработки в этой области теперь позволяют исследовать эффекты многих мутаций на ген в геноме. Например, у дрожжей методы конструирования высокопроизводительных библиотек штаммов позволили измерить тысячи эффектов приспособленности вариантов параллельно по геному ^10–14 .Эти подходы основаны на модификациях генома на основе CRISPR-Cas9, требующих образования двухцепочечных разрывов с последующей репарацией с использованием донорской ДНК, которая часто зависит от сложного штамма и плазмидных конструкций. Альтернативный подход заключался бы в использовании редакторов оснований, которые позволяют вводить интересующие мутации непосредственно в геном путем прямой модификации оснований ДНК, а не замены сегмента ДНК.

Базовые редакторы используют модифицирующие ДНК ферменты, слитые с модифицированными белками Cas9 или Cas12, для создания специфических точечных мутаций в целевом геноме ^15–17 .Такие базовые редакторы недавно были использованы для выполнения сайт-специфического прямого мутагенеза в линиях клеток человека. Два основных подхода, целевой AID-опосредованный мутагенез (ТАМ) ¹⁸ и CRISPR-X ¹⁹ , нацелены на конкретные области генома, где они случайным образом вызывают мутации. Это создает библиотеку мутантных генотипов, с которыми можно конкурировать, чтобы найти полезные и вредные варианты под давлением отбора. Поскольку измерения относительной приспособленности зависят от целевого секвенирования интересующего локуса, эти подходы трудно адаптировать к высокопроизводительным мультиплексированным экранам, когда десятки тысяч сайтов могут быть нацелены в рамках одних и тех же библиотек gRNA.

Здесь мы представляем метод, который объединяет гибкость мутагенеза Target-AID и возможности мультиплексирования экранов истощения редактирования генома. Используя базовый редактор с узким и четко определенным окном активности ¹⁵ , мы выбрали гРНК, генерирующие ограниченное количество предсказуемых изменений в основных генах дрожжей. Это позволило нам использовать gRNA для считывания эффекта мутаций, аналогично широко используемым подходам к секвенированию штрих-кода для измерения эффектов приспособленности.

Результаты

Дизайн базовой библиотеки редактирования, нацеленной на основные гены

Мы использовали мутагенез Target-AID для одновременной оценки мутационных эффектов в более чем 17000 предполагаемых сайтах в геноме дрожжей. Мы просканировали основные гены дрожжей на предмет сайтов, которые можно редактировать с помощью редактора базы Target-AID, а также мишеней с другими специфическими свойствами, включая интронные последовательности. Поскольку все основные гены имеют одинаковые качественные эффекты приспособленности при удалении ²⁰ , сосредоточение внимания на этих генах позволило нам ограничить вариации приспособленности, которые могут быть связаны с относительной важностью отдельных генов для роста, а не с важностью конкретных позиций внутри. локус.Мы исключили гРНК, которые не были нацелены между 0,5 и 75 процентилями длины аннотированных генов, чтобы ограничить смещения положения, которые могут влиять на эффективность направляющих, генерирующих стоп-кодоны ^{21, 22} .

Чтобы связать каждую gRNA в библиотеке с конкретными результатами редактирования базы, мы разработали простую модель, основанную на данных о дрожжах, включенных в исходную рукопись Target-AID, а также на нашей собственной работе ^{15, 23} . Во-первых, мы ожидали, что редактирование в основном приведет к генотипам, в которых в окне активности редактора редактируется только один нуклеотид.Во-вторых, мы предсказали, что результаты редактирования будут в основном состоять из мутаций от C до G и от C до T, а количество продуктов от C до A будет незначительным. Наконец, мы ожидали, что ранги частоты редактирования будут следовать за ранжированием активности редактирования, уже известным из первоначальной характеристики Target-AID. Основываясь на этих критериях, мы отфильтровали потенциальные сайты-мишени, где все три положения с высокой скоростью редактирования (-19, -18 и -17), или те, где положения -18 и -17 являются цитозинами, и оставили оставшиеся сайты для включения в гРНК. библиотека.Полученная библиотека содержала 40000 гРНК, из которых ~ 35000 нацеленных кодирующих последовательностей основных генов и ~ 5000 других типов-мишеней, как показано на дополнительном рисунке 1.

Более 75% целевых последовательностей в этом наборе содержали только один или два Cs в расширенное окно активности (позиции от -20 до -14) и, как ожидалось, общее обогащение цитозинами в окне высокой активности (дополнительный рисунок 2A-B). Поскольку цель нашего эксперимента состояла в том, чтобы связать определенные мутации с эффектами приспособленности, совместное редактирование нескольких нуклеотидов с помощью редактора, который не направляет мутации на конкретный результат, может скрыть генотип, ответственный за эффект приспособленности.Чтобы принять это во внимание, мы поместили каждую гРНК в категорию риска совместного редактирования на основе присутствия и положения цитозинов в окне активности (см. Методы). Основываясь на этой метрике, мы обнаружили, что более 80% гРНК относятся к категории очень низкого или низкого риска (дополнительный рисунок 2C). Если совместное редактирование происходит, но другой мутировавший цитозин является частью того же кодона, что и предполагаемый сайт-мишень, то любые результирующие эффекты приспособленности все еще могут быть связаны с нарушением конкретной аминокислоты.Мы обнаружили, что доля гРНК в библиотеке, для которой это верно, превышает 50%: если принять во внимание категорию риска совместного редактирования, эта доля достигает ~ 90% (дополнительный рисунок 2D). Поскольку известно, что Target-AID выполняет процессивное редактирование, высокий риск совместного редактирования также может быть связан с более высокой общей скоростью редактирования ¹⁵ .

Измерение скорости мутагенеза и результатов библиотечных гРНК

Хотя результаты редактирования продуктов репарации для гРНК могут быть предсказаны с различными уровнями точности для редактирования на основе CRISPR-Cas9 ²⁴ , такие инструменты пока недоступны для базового редактирования Приложения.Таким образом, модель, которую мы использовали для связывания гРНК в нашей библиотеке с мутационными результатами, является лишь скупым выводом, основанным на исходных данных Target-AID и нашей предыдущей работе ^{15, 23} . Более того, оценка активности gRNAs для редактирования оснований остается сложной ²⁵ . Измерение эффектов приспособленности не связано с прямым одновременным измерением скорости мутагенеза в нашем эксперименте. Таким образом, отсутствие эффектов приспособленности для гРНК может быть объяснено либо нефункциональным, либо низким редактированием, либо успешным редактированием, которое привело к мутациям без обнаруживаемых эффектов приспособленности ²³ .Поскольку наш эксперимент сосредоточен на влиянии целевых мутаций на рост клеток, первая группа может рассматриваться как ложноотрицательные, а вторая — как истинно отрицательные. Хотя мы можем модулировать порог вариации обилия гРНК, чтобы минимизировать риск ложноположительных результатов, потребовались дополнительные экспериментальные данные об успешности мутагенеза и результатах редактирования, чтобы оценить, какой тип отрицательных результатов будет доминирующим в нашем эксперименте.

Чтобы оценить производительность нашей модели и функциональность библиотечных гРНК, мы провели базовый эксперимент с временным курсом редактирования, в котором скорость и результаты мутагенеза измерялись путем глубокого секвенирования отредактированных геномных локусов (дополнительный рисунок 3).Чтобы получить представление о результатах мутагенеза при различных сценариях редактирования, мы выбрали руководства с различными предсказанными паттернами присутствия цитозина в окне активности Target-AID (рис. 1A). Мы включили 9 руководств из библиотеки, выделенной в процессе контроля качества библиотеки (см. Методы), а также три контрольных гРНК, нацеленных соответственно на псевдоген YCL074W, несущественный ген VPS17 и ADE1 , которые можно использовать в качестве фенотипический маркер. Большинство гРНК могут эффективно редактировать свои соответствующие мишени, при этом 9 из 12 гРНК достигают частоты мутаций 50% или выше (рис. 1B), что согласуется с предыдущими результатами ^{15, 23} .Реплики сильно коррелировали по разным измерениям, при этом скорость редактирования на сайте совместного редактирования CAN1 и была очень согласованной (дополнительный рисунок 4A-E). Только gRNA, нацеленная на SES1 , оказалась неактивной и как таковая была исключена из последующего анализа. Очень низкая скорость редактирования, наблюдаемая для гРНК, нацеленной на SES1 , является примером неизвестных факторов, влияющих на эффективность мутагенеза, что приводит к ложноотрицательным результатам в крупномасштабных экспериментах.

A) гРНК, включенных в эксперимент по редактированию временной базы, имели различные профили содержания C в окне активности Target-AID. Нуклеотиды имеют цветовую маркировку: гуанины фиолетовые, тимины красные, аденины зеленые и цитозины синие. B) Общая доля отредактированных считываний для всех участков-мишеней в определенные моменты времени в эксперименте: T0 (начало индукции), T6 (середина индукции), T12 (конец индукции). Сплошная временная точка представляет выжившие клетки, посеянные после индукции галактозы, а жидкая временная точка представляет популяцию клеток после совместного отбора канаванина.Амплификация целевого сайта ERO1 по временным точкам восстановления жидкости не увенчалась успехом (показаны серым цветом), и, как таковая, временная точка восстановления твердого вещества использовалась вместо этого для других этапов анализа. C) Фракция генотипов с различным количеством отредактированных нуклеотидов в окне активности Target-AID после совместного отбора для каждого локуса. Значения представляют собой долю считываний с одним, двумя или тремя изменениями по сравнению с общей долей считываний, которые были отредактированы. D) Тип результата редактирования для всех сайтов с общей скоростью редактирования более одного процента после совместного отбора (n = 30 цитозинов по всем целевым сайтам).Распределение C в G / T представляет собой сумму редактирования, которое привело к мутации C в G или C в T. Позиционная скорость редактирования и результат показаны на дополнительных рисунках 5 и 6. E) Согласованность между прогнозируемым общим рангом редактирования нуклеотидов в модели, используемой для прогнозирования результатов мутагенеза в крупномасштабном эксперименте, и данными глубокого секвенирования (n = 28 сайтов, 10 гРНК: прогнозируемые и наблюдаемые специфические для гРНК ранжирования представлены на дополнительных рисунках 5 и 6). ГРНК, нацеленные на ADE1 и SES1 , были соответственно исключены из анализа, потому что в окне активности есть только один редактируемый сайт и общая скорость редактирования была слишком низкой. F) Отредактированный охват чтения модели прогнозирования исхода мутации и 99-й процентиль отредактированных комбинаций аллелей (n = 4 генотипа в обоих случаях) для гРНК с активностью редактирования, включенной в крупномасштабный эксперимент.

В нашей модели редактирования мы сначала предсказываем, что одиночные мутанты будут основным результатом мутагенеза в процессе редактирования базы. Мы обнаружили, что это верно для 9 гРНК из 10 с более чем одним цитозином в окне активности Target-AID (рис. 1C). Во-вторых, наша модель считает редактирование C в A редким и поэтому игнорирует их в пользу более распространенных мутаций C в G и C в T.Мы наблюдаем это смещение в данных глубокого секвенирования (рис. 1D), при этом медианная занятость генотипов от C до G и от C до T в отредактированных аллелях намного больше, чем занятость от C до A (от C до T по сравнению с C до A: Вт. = 0, p = 1,73 × 10 ^-6 , от C до G vs от C до A: W = 41, p = 8,19 × 10 ^-5 , двусторонний знаковый ранговый критерий Вилкоксона). Включение этих мутаций, как в нашей модели, приводит к медианному охвату 93% результатов мутагенеза. Наши данные секвенирования также показали большую распространенность мутаций C в T по сравнению с C и G ( W, = 112, p = 0.01), но если принять во внимание абсолютную скорость редактирования, эта разница исчезнет (дополнительный рисунок 4F). Наконец, в случаях, когда несколько редактируемых нуклеотидов присутствуют в окне активности основного редактора, наша модель использует количественные данные исходной рукописи Target-AID, чтобы качественно предсказать, какая позиция должна редактироваться с наибольшей частотой. Мы обнаружили, что этот прогнозирующий метод редактирования ранга в окне активности в большинстве случаев совпадает с экспериментальными данными (рис. 1E), что вряд ли произойдет случайно (p ≈ 0.0004 на основе 1 × 10 ⁶ случайных перестановок рангов). В глобальном масштабе мы обнаружили, что отредактированный пул аллелей в основном состоит из генотипов, предсказанных нашей моделью: для 8 гРНК с активностью редактирования, поступивших из библиотеки, средняя доля отредактированных прочтений, охватываемых нашей моделью, составляла 69% (рис. 1F). . В 7 из 8 случаев доли отредактированных прочтений, охватываемые моделью, были лучше, чем 99-й процентиль случайных комбинаций результатов, и в 6 из 8 случаев, а также превосходили 99.9-й процентиль. В целом, эти результаты подтверждают, что большая часть гРНК, включенных в нашу библиотеку, может редактировать свои геномные мишени эффективным и предсказуемым образом.

Высокопроизводительный скрининг с использованием библиотеки gRNA

Библиотека gRNA была клонирована в вектор редактирования базы совместного отбора с высокой пропускной способностью ²³ . Мы выполнили объединенный мутагенез с последующим массовым соревнованием (дополнительный рисунок 7) для выявления мутаций со значительными эффектами приспособленности (рисунок 2).Поскольку относительная численность каждой гРНК в экстрагированном пуле плазмид зависит от численности субпопуляции клеток, несущих эти гРНК, любой эффект приспособленности, вызванный мутацией, которую они вызывают, будет влиять на их относительную численность. Вариация численности плазмид измерялась с помощью целевого секвенирования следующего поколения вариабельного локуса гРНК на базовом редактирующем векторе способом, аналогичным подходам GeCKO ^{6, 26} .

Основные гены (например: E.G.1 ) сканировали на сайты, подходящие для мутагенеза Target-AID. Мутации включают молчащие (серый треугольник), миссенс (черный треугольник) мутации, а также стоп-кодоны (*). Фрагменты ДНК, соответствующие последовательностям гРНК, были синтезированы в виде пула олигонуклеотидов и клонированы в вектор редактирования оснований совместного отбора. Затем, используя гРНК в качестве молекулярных штрих-кодов, после мутагенеза и массовой конкуренции измеряется количество клеточных субпопуляций, несущих мутации.Мутации с эффектами приспособленности выводятся из снижения относительной численности гРНК.

После применения строгого порога фильтрации, основанного на подсчете считывания гРНК на этапе мутагенеза (см. Методы), мы идентифицировали в общей сложности около 17 000 гРНК, для которых мы могли оценить эффекты приспособленности. Репликация данных для гРНК, соответствующих критериям выбора минимального числа считываний, показала высокую корреляцию между экспериментальными временными точками (дополнительный рисунок 8) и кластеризацию по экспериментальному этапу (дополнительный рисунок 9), показывая, что этот подход является воспроизводимым.Используя распределение вариации численности гРНК между началом скрининга и концом фиктивной индукции глюкозы как нулевое распределение, мы идентифицировали 1118 гРНК в 605 локусах со значительными отрицательными эффектами (GNE) на выживаемость или пролиферацию клеток при 5% ложном обнаружении Скорость (рисунок 3A, дополнительный рисунок 9 B и C). GNEs равномерно распределены по геному дрожжей (рис. 3B), что свидетельствует об отсутствии врожденной предвзятости по отношению к конкретным регионам. Пример изменения количества гРНК во времени для всех гРНК (как GNE, так и NSG), нацеленных на GLN4 , показан на рисунке 3C.

A) Кумулятивное распределение z-показателей логарифмического 2-кратного изменения содержания gRNA между мутагенезом и окончанием эксперимента с массовым соревнованием. Баллы были рассчитаны с использованием распределения вариации численности между началом эксперимента и концом введения в действие фиктивного редактора, аппроксимированное нормальное распределение показано черной линией. Пороговое значение z-оценки было установлено на уровне ~ 5% FDR и представлено пунктирной черной линией.Распределение типов мишеней в 1118 гРНК с отрицательными эффектами (GNE) показано на вставке. B) Положения целевых сайтов редактирования оснований в геноме дрожжей. Теломерные области истощены в сайтах-мишенях, потому что там находится очень мало важных генов. GNE показаны красным цветом, а другие gRNA — черным. Ориентация линии соответствует целевой нити относительно аннотированной кодирующей последовательности. C) Снижение количества гРНК (в логарифмической шкале) между точками времени после мутагенеза для гРНК, нацеленных на GLN4, тРНК-синтетазу.Среднее содержание гРНК во всей библиотеке с течением времени показано зеленым. Красные линии представляют собой gRNA, отнесенные к категории обладающих значительным эффектом (GNE) для этого гена, в то время как несущественные gRNA (NSG) показаны черным. ГРНК с самым экстремальным z-значением нацелена на остаток G267. D) Мутагенез GLN4-G267 подтверждает его важную роль в функции белка. Тетрадное рассечение мутанта с гетерозиготной делецией, несущего пустой вектор, приводит только к двум жизнеспособным спорам, в то время как копия дикого типа в том же векторе восстанавливает рост.Рассечение двух гетерозиготных мутантов, несущих плазмиду с наиболее вероятным одиночным мутантом на основе известного окна активности Target-AID, показывает, что обе мутации являются летальными.

Поскольку наш скрининг специально нацелен на основные гены, многие гРНК вызывают мутации в высококонсервативных областях с высокой функциональной важностью. Чтобы проиллюстрировать это, мы сосредоточимся на GNE с наивысшим баллом, нацеленной на GLN4 , тРНК-синтетазу. GRNA 33725 мутирует глицин в положении 267 либо в аргинин, либо в серин, и в крупномасштабном эксперименте показала резкое снижение численности.Чтобы подтвердить вредоносность предсказанных мутаций, мы трансформировали центромерную плазмиду, несущую дикую или мутированную копию гена под контролем ее нативного промотора ²⁷ , в фон гетерозиготной делеции ²⁸ (дополнительная фигура 10A). Глицин 267 является частью мотива «HIGH», характерного для тРНК-синтетаз класса I, участвует в связывании и катализе АТФ и является высококонсервативным в процессе эволюции ²⁹ . Как и ожидалось, область вокруг мотива «HIGH» демонстрирует как низкую скорость эволюции, основанную на межвидовых сравнениях, так и гораздо более низкую плотность вариантов в популяциях дрожжей по сравнению с другими доменами Gln4 (дополнительный рисунок 10B), демонстрируя сохранение обоих на коротком отрезке. и долгие сроки.Неожиданно эксперименты по мутагенезу бактериального гомолога MetRS пришли к выводу, что мутация этого остатка с глицина на аланин не меняет значительного катализа, тогда как мутация его на пролин имеет сильный разрушительный эффект ³⁰ . Мы обнаружили, что мутации Gly 267 либо в Arg, либо в Ser было достаточно, чтобы вызвать потерю функции белка (рис. 3D).

Пять других чувствительных сайтов, идентифицированных нашим скринингом в GLN4, также были сгруппированы в регионах с медленными темпами эволюции. Мы обнаружили, что еще один нацеленный на GNE остаток D291 индуцировал очень вредную мутацию в сочетании с нейтральной мутацией в качестве результата (D291E против D291D, дополнительная фигура 11).Мы не наблюдали каких-либо заметных дефектов роста для других исходов GNE, а также для исходов 4 NSG, нацеленных на соседние аминокислоты. У других протестированных GNE было заметно больше положительных результатов, чем у теста, нацеленного на G267, что привело бы к более высокому уровню ложноположительных результатов, близкому к порогу значимости. Однако случай пары D291E / D291D, где сильный эффект приспособленности частично скрывается нейтральной мутацией, вызванной другими результатами мутагенеза, подтверждает, что представляющие интерес сайты могут быть обнаружены даже близко к порогу значимости.Поскольку мы тестировали только два результата на гРНК, также возможно, что некоторые из измеренных нами падений численности были результатом мутаций за пределами нашей модели, которые иногда предсказываются как более вредные, чем наиболее вероятные мутации.

Сравнение мутаций, индуцированных GNE, с предсказаниями эффектов вариантов

Если GNE действительно вызывают специфические вредные мутации, следует прогнозировать, что эти мутации будут более вредными, чем мутации несущественных гРНК (NSG). Мы протестировали это с помощью двух недавно опубликованных ресурсов для прогнозирования вариантных эффектов: Envision ² и Mutfunc ³¹ .Envision основан на подходе машинного обучения, который использует данные крупномасштабного насыщенного мутагенеза нескольких белков для выполнения количественных прогнозов влияния миссенс-мутаций на функцию белков. Чем ниже оценка Envision, тем выше влияние на функцию белка. Mutfunc объединяет несколько типов информации, например, о сохранении остатков, с помощью SIFT ³² , а также структурных ограничений для обеспечения бинарного прогнозирования вариантного эффекта на основе нескольких количественных и качественных значений.Мутации с низким показателем SIFT имеют более низкий шанс на переносимость, в то время как мутации с положительным значением ΔΔG, по прогнозам, дестабилизируют структуру белка или взаимодействия. Агрегированные данные SIFT как Envision, так и Mutfunc охватывают большинство наиболее вероятных мутаций, генерируемых библиотекой gRNA (дополнительный рисунок 12A). Информация о структурном моделировании имела гораздо меньший охват, охватывая в лучшем случае около 12% наиболее вероятных мутаций (дополнительный рисунок 12B). Как и ожидалось, мутации, генерируемые GNE, показали значительно более низкие оценки SIFT и продемонстрировали обогащение для сильных эффектов, предсказанных SIFT и Envision (рис. 4).В самом деле, все четыре наиболее вероятные замены, созданные GNEs, примерно в два раза более вероятно будут иметь большой вредный эффект Envision или очень низкую вероятность того, что они будут переноситься, как предсказано SIFT, по сравнению с NSG gRNAs. Оценки видимости по протеомуу показывают высокий уровень гомогенности, при этом большинство мутаций имеют оценку от 0,94 до 0,96 (дополнительная фигура 12C). Согласно оригинальной рукописи Envision, это должно указывать на небольшое снижение функции белка.Таким образом, сдвиги в распределении оценок между GNE и NSG более тонкие, но все же подтверждают, что мутации, вызванные GNE, обычно также более опасны (дополнительный рисунок 13A).

A) Распределение баллов SIFT для наиболее вероятных индуцированных мутаций как GNE (синий), так и NSG (красный). Пороговые значения для категорий, используемых в расчетах обогащения в B) , показаны черными пунктирными линиями.Показатели SIFT представляют собой вероятность того, что конкретная мутация будет переноситься на основе эволюционной информации: первый порог 0,05 был установлен авторами в исходной рукописи ³² , но может быть допустимым, учитывая количество мутаций, испытанных в нашем эксперименте (n = 895 , 12394, 704, 8520, 643, 7396, 508, 5682). Все сравнения показателей GNE и NSG значимы (p-значения t-критерия Велча: 1,19 × 10 ^–24 , 3,01 × 10 ^–24 , 9,00 × 10 ^–12 , 1,55 × 10 ^–12 ).Граница рамки обусловлена ​​большой долей мутаций, для которых оценка SIFT равна 0. B) Накопление GNE по сравнению с NSG для различных измерений прогнозирования эффектов. Оценка Envision (Env.), Оценка SIFT (SIFT), стабильность сворачивания белка на основе решенных белковых структур (Struct. ΔΔG), сворачивание белка на основе моделей гомологии (Модель ΔΔG) и стабильность интерфейса взаимодействия белок-белок на основе данных структуры (Inter . ΔΔ G). Необработанные значения, используемые для расчета соотношений, показаны в дополнительной таблице 1.Прогнозы, основанные на сохранении и экспериментальных данных, сгруппированы в разделе «Предикторы», а прогнозы, основанные на компьютерном анализе белковых структур и комплексов, в разделе «Структурные».

Мутации с дестабилизирующим эффектом, предсказанные структурными данными, также, по-видимому, обогащены мутациями, предсказанными GNE, но низкий охват остатков ограничивает силу этой ассоциации. Это подтверждается необработанными распределениями значений ΔΔG, которые показывают значительную тенденцию мутаций GNE быть более дестабилизирующими (p-значения t-критерия Велча для GNE по сравнению с NSG ΔΔG: C-to-G # 1 0.0001, C-to-T # 1 0,0064, C-to-G # 2 0,148, C-to-T # 2 0,007, дополнительный рисунок S13B-D). Однако сдвиг в распределении достиг значимости только для определенных предсказаний мутаций, основанных на решенных структурах и моделях гомологии. Хотя низкий уровень покрытия остатков ограничивает наши статистические возможности, это слабое очевидное обогащение мутаций, влияющих на стабильность белка, может иметь ограниченное влияние на приспособленность. Как и ожидалось из известных экспериментальных данных по результатам мутагенеза ¹⁵ , сигнал обычно был сильнее для наиболее вероятной мутации C в G.

Чувствительные сайты обеспечивают новое биологическое понимание

Поскольку Target-AID может генерировать только ограниченный диапазон аминокислотных замен из конкретной кодирующей последовательности, мы исследовали, были ли какие-либо из этих мутационных паттернов обогащены GNE (рис. 5A, исходные данные в дополнительном материале). таблицы 2, 3 и 4). Мы обнаружили отклонения от случайных ожиданий в соотношениях мутаций C-to-G и C-to-T, которые привели к обогащению нескольких комбинаций мутаций. Три из четырех паттернов пар мутаций с участием глицина были обогащены GNE.Например, замещения глицина на аргинин или серин (как показано в руководстве 33725, нацеленном на GLN4 ) является вторым наиболее обогащенным паттерном, который почти в четыре раза больше представлен в результатах GNE. Этот образец согласуется с тем фактом, что аргинин имеет свойства, сильно отличающиеся от свойств глицина ³⁴ , что делает эти замены очень вредными. Более того, поскольку остатки глицина часто являются важными компонентами мотивов связывания кофакторов (например, фосфатов) ³⁵ , это наблюдение может отражать тенденцию GNEs изменять эти сайты.

A) Сложите графики вулканов истощения и обогащения для наиболее вероятных мутаций, вызванных GNE на экране. Значения обогащения и истощения были рассчитаны путем сравнения относительной распространенности каждой мутации среди GNE и NSG с использованием точных тестов Фишера. Существенно истощенные паттерны мутаций показаны синим, а те, которые обогащены, — красным.Порог значимости был установлен с использованием метода Холма-Бонферрони на уровне 5% FDR и показан серой пунктирной линией. B) Частота вариантов белка среди 1000 дрожжевых изолятов (черные точки) и скорость эволюции остатков между видами (синяя линия) для RAP1 . Целевой сайт для GNE, нацеленных на T486, выделен красной линией, в то время как другие обнаруженные целевые сайты GNE показаны серой линией. C) Тетрадные рассечения подтверждают, что большинство индуцированных мутаций RAP1 и GNE действительно имеют сильные эффекты приспособленности, а также другие замены, нацеленные на эти сайты.

Как и ожидалось, в GNEs наблюдается сильное обогащение паттернов, которые приводят к мутации для остановки кодонов: оба паттерна C-to-G (Y для остановки: 3-кратное обогащение, p = 3,62 × 10 ^-11 , S до стоп: обогащение в 2,2 раза, p = 0,0002), но только один образец C-to-T был значительно перепредставлен (W для остановки, 4,6-кратное обогащение, p = 6,23 × 10 ^-15 ). Замены на стоп-кодон в одном исходе также привели к обогащению в другом: например, связь между серином и стоп (C-to-G), по-видимому, является причиной чрезмерного представительства серина в лейцин (C-to-T).Обе пары мутаций, включающие мутацию триптофана до остановки с помощью мутации C-to-T, обогащены: это неудивительно, поскольку альтернативные мутации триптофана в серин или цистеин также очень разрушительны. ³⁴ . Изменения между подобными аминокислотами, которые, как ожидается, будут переносимыми, также, как правило, были истощены по GNE (например: пара аланин к глицину / валину). Мутации в интронных последовательностях и предполагаемых нефункциональных пептидах также были недостаточно представлены, как и большинство паттернов, ведущих к молчащим мутациям (рис. 5А).Эти результаты показывают силу этого подхода в различении важных функциональных сайтов от более толерантных к мутациям по всему геному.

Интересно, что гены, для которых было обнаружено более одного GNE, были обогащены терминами молекулярной функции, связанными со связыванием кофактора (дополнительная таблица 5). Это указывает на то, что GNEs действительно может иметь тенденцию влиять на функцию белков посредством механизмов, отличных от белков или дестабилизации интерфейса взаимодействия. Эти свойства белка зависят от многих остатков, что делает их более устойчивыми к заменам одной аминокислоты, тогда как связывание кофактора может зависеть конкретно от нескольких остатков, что делает эти участки критически важными для функции.Используя базу данных Uniprot ³⁷ , мы также исследовали, влияют ли гРНК, нацеленные на аннотированные сайты связывания или высококонсервативные мотивы, на приспособленность по сравнению с другими gRNA, нацеленными на тот же набор генов. Мы обнаружили обогащение в 3,5 раза для GNE, непосредственно влияющих на эти участки (49/188, отношение ^{GNE On} = 0,261, соотношение 447/5969 ^{GNE Off} = 0,0749, двусторонний точный тест Фишера p = 3,54 × 10 ^-14 ) или остатки в двух аминокислотном окне вокруг них (23/138, соотношение ^{GNE около} = 0.167, 447/5969, отношение ^{GNE Off} = 0,0749, двусторонний точный тест Фишера p = 0,00048).

Точное нацеливание нашего метода также позволяет нам исследовать аминокислотные остатки с известными функциональными аннотациями, такими как посттрансляционные модификации. Мы не обнаружили значительного обогащения гРНК, мутирующих непосредственно аннотированные PTM (соотношение ^{GNE PTM} = 19/1118, соотношение ^{NSG PTM} 243/15536, точный тест Фишера p = 0,71). Большинство этих сайтов были сайтами фосфорилирования (7), остатками координации металлов (5) и сайтами убиквитинирования (4).Это согласуется с гипотезой о том, что многие сайты PTM могут иметь небольшое функциональное значение ³⁶ , и поэтому мутации, влияющие на них, не должны быть значительно обогащены для сильных эффектов приспособленности по сравнению с другими возможными мутациями. То же самое наблюдалось для гРНК, мутирующих остатков рядом с известными PTM, которые могут нарушать сайты узнавания (соотношение ^{GNE nearPTM} = 130/1118, соотношение ^{NSG nearPTM} = 1698/15536, точный критерий Фишера p = 0,43). Поскольку мы специально не нацелены на PTM, размер нашей выборки невелик, и следует отметить, что статистическая мощность в отношении этих наблюдений ограничена.

Однако GNE, которые действительно нацелены на аннотированные сайты PTM, могут предоставить дополнительные доказательства, подтверждающие важность именно этих сайтов. Например, предсказано, что GNE с наилучшей оценкой в ​​хорошо изученном регуляторе транскрипции RAP1 мутирует остаток T486. Этот треонин был фосфорилирован в двух предыдущих исследованиях ^{38, 39} , но функциональное значение этого фосфорилирования еще не изучено. Остаток T486 расположен в неупорядоченной области в ДНК-связывающих доменах ⁴⁰ , которые являются частью единственного фрагмента RAP1 , необходимого для роста клеток ^{41, 42} .Поскольку доступная плазмида RAP1 дикого типа (см. Методы) не дополняет фенотип роста с делецией гена, мы использовали другую стратегию для проверки, основанную на CRISPR-опосредованном включении (см. Методы и дополнительную фигуру 14). Мы протестировали эффект нескольких предсказанных GNE-индуцированных мутаций в положениях нацеливания RAP1 T486, A510, R523 и A540 (рис. 5B-C). Мы обнаружили, что предсказанные мутации в двух из этих положений, R523 и A540, были очень вредными. Хотя мы не смогли подтвердить, что две наиболее вероятные мутации, которые, как предсказано, были вызваны GNE, нацеленным на T486, имели заметный эффект приспособленности в этих условиях, мы обнаружили, что фосфомиметические мутации в этом положении были летальными, но большинство других аминокислот хорошо переносились.Хотя мы могли подтвердить, что эта гРНК действительно нацелена на чувствительный сайт, результаты, предсказанные нашей моделью, не имели каких-либо заметных эффектов приспособленности. Это демонстрирует ограничение нашего подхода: неопределенность в прогнозе результатов может усложнить валидационные исследования. Поскольку мы тестировали выживаемость потомства только на богатой среде и при разрешающей температуре, а скрининг проводился в синтетической среде при 30 ° C, эти мутанты могут по-прежнему влиять на фенотип клеток, но в зависимости от окружающей среды.

Свойства гРНК влияют на эффективность мутагенеза

До сих пор существует очень мало доступных высокопроизводительных экспериментальных наборов данных, которые позволяют исследовать, какие свойства гРНК влияют на эффективность редактирования в контексте базового редактирования.Поэтому мы стремились изучить, какие особенности гРНК и последовательности-мишени могут влиять на эффективность мутагенеза. Для этого мы сосредоточились на подмножестве гРНК с потенциалом генерировать стоп-кодоны (гРНК, генерирующие стоп-кодоны, SGG) в основных генах (рис. 6А). Поскольку гРНК в нашей библиотеке были разработаны для нацеливания на первые 75% кодирующих последовательностей, успешная генерация стоп-кодонов в этом подмножестве генов часто должна приводить к летальной потере функции ^{13, 22} .

A) Поскольку Target-AID может генерировать как мутации C в G, так и C в T, многие кодоны могут быть нацелены на создание преждевременных стоп-кодонов. Кодон TGG (W) — единственный, нацеленный на некодирующую цепь как ACC. B) Коэффициент GNE для SGG, нацеленных на разные кодоны в основных генах, разделенных по категориям риска совместного редактирования, где 1 и 2 представляют низкий или очень низкий риск совместного редактирования, а 3 или 4 представляют собой средний или высокий риск совместного редактирования. C) Кумулятивная z-оценка плотности SGG, сгруппированных по результату мутации, генерирующему стоп-кодон.Более высокая скорость GNE наблюдается для гРНК, для которых мутация C-to-G в положении с наивысшей редактирующей активностью генерирует мутацию стоп-кодона. Порог значимости показан черной пунктирной линией. D) Кумулятивная плотность z-значения гРНК, которые не генерируют стоп-кодоны, нацеленные на кодирующую или некодирующую цепь. E) Обогащение SGG и non-SGG GNE по сравнению с ожидаемым соотношением GNE для различных диапазонов температур плавления. F) Температура плавления дуплекса гРНК / ДНК как функция GC содержания гРНК для всех гРНК, для которых были измерены эффекты приспособленности.Верхний и нижний пороги эффективности основаны на обогащении, показанном на панели E.

Мы обнаружили важные различия в соотношении GNE для разных типов SGG (рис. 6B), при этом gRNAs нацелены на кодоны TGG (Trp), имеющие наивысшую активность. . Это противоречит общей тенденции, так как в целом мутация C-to-G, приводящая к образованию стоп-кодонов, имела более высокие отношения GNE, чем три других альтернативы C-to-T. В целом, мы наблюдали значительное обогащение GNE в SGG, которые зависят от первой мутации C в G, чтобы вызвать образование стоп-кодонов (рис. 6C).Множественные факторы могут объяснить более высокую эффективность гРНК, нацеленных на TGG. Во-первых, поскольку большинство этих сайтов имеют высокие оценки риска совместного редактирования из-за двух последовательных цитозинов, они могли иметь повышенную скорость редактирования из-за процессов совместного редактирования, увеличивая вероятность обнаружения эффекта приспособленности. Этот феномен может также возникать в не-SGG gRNAs (дополнительная фигура 15A). Во-вторых, мы обнаружили значительное обогащение GNEs для gRNAs, нацеленных на некодирующую цепь, даже после исключения SGG (рис. 6D).Этот эффект можно объяснить более высокой эффективностью репарации транскрибируемой цепи у дрожжей ⁴³ . Кроме того, поскольку некодирующая цепь является той, которая транскрибируется, событие дезаминирования может привести к последствиям на уровне белка быстрее, когда транскрибируется мутированная кодирующая последовательность. Напротив, целевая хромосомная цепь, по-видимому, гораздо менее важна (дополнительный рисунок 15B). Различия в соотношении GNE, наблюдаемые между разными кодонами-мишенями SGG, также могут отражать in vivo предпочтения репарации ДНК, которые зависят от контекста последовательности, где различные исходы могут быть предпочтительными в зависимости от целевой последовательности.Например, динуклеотид CA может способствовать мутациям C в G, что могло бы объяснить низкое соотношение GNE для CAA (Gln), нацеленных на SGG, и более высокое, чем среднее отношение GNE для TCA (Ser), нацеленных на SGG.

Другим параметром, оказывающим большое влияние на обогащение GNE в наборах гРНК, является прогнозируемая температура плавления дуплекса РНК-ДНК, образованного последовательностью гРНК и ее последовательностью ДНК-мишени (дополнительный рисунок 15C-D). Как SGG, так и не-SGG гРНК с низкими значениями имеют меньший шанс быть обнаруженными как имеющие эффекты, в то время как гРНК с более высокими значениями обогащены GNE (рис. 6E).Это обогащение нельзя отнести к техническим ошибкам при подготовке библиотек или высокопроизводительному секвенированию, которые могут снизить их численность, поскольку температура плавления практически не коррелирует с подсчетом считываний в любой момент времени (дополнительный рисунок 16). Кроме того, этот эффект не вызван смещением целевой позиции в генах-мишенях или сильной корреляцией между содержанием GC и целевой позицией (дополнительный рисунок 17). Даже если энергия связывания сильно коррелирует с содержанием GC, все еще существует значительная вариация в наборах gRNA с тем же% GC (рис. 6F).

Обсуждение

Используя целевое глубокое секвенирование и высокопроизводительный скрининг, мы исследовали, подходит ли редактор базы Target-AID для исследований целевого мутагенеза в масштабе генома. Мы показываем, что модель прогнозирования, основанная на известных свойствах Target-AID, может использоваться для прогнозирования основного мутационного результата редактирования, даже если в окне активности присутствует несколько редактируемых нуклеотидов. Используя основные гены дрожжей в качестве тестового примера, мы затем применили этот подход в более крупном масштабе и идентифицировали сотни гРНК, нацеленных на чувствительные остатки, которые оказывают значительное влияние на приспособленность клеток при мутации.Затем мы могли бы ортогонально проверить эффекты мутационных исходов GNE, используя подходы классической генетики, и показать, что они имеют тенденцию перекрываться с вариантами, которые, по прогнозам, могут быть вредными. Сосредоточившись на нескольких очень актуальных наборах вариантов, мы подчеркнули силу и потенциал нашего подхода к созданию новых биологических идей. Затем мы использовали эти данные, чтобы исследовать, какие факторы влияют на эффективность редактирования базы, и обнаружили несколько гРНК и целевые свойства, которые влияют на мутагенез и которые могут быть оптимизированы для будущих экспериментов в конкретных геномных пространствах.

В ранее опубликованных методах, таких как TAM и CRISPR-X ^{18, 19} , полуслучайный характер редактирования вынуждает использовать частоты мутантных аллелей в качестве считывания для эффектов мутационной пригодности, потенциально ограничивая масштаб экспериментов, поскольку единовременно может быть нацелена только одна область генома. Чтобы дополнить эти подходы, мы используем более предсказуемое базовое редактирование, чтобы резко увеличить количество целевых локусов, хотя и за счет более низкой плотности мутаций. Наши результаты демонстрируют осуществимость скрининга базового редактирования в крупном масштабе с приложениями, выходящими за рамки генерации стоп-кодонов, и будущие разработки будут способствовать его дальнейшему совершенствованию.Например, использование базового редактора с множеством возможных результатов мутагенеза усложняет прогнозирование результатов редактирования, что, в свою очередь, может затруднить последующее наблюдение GNE. Использование базового редактора, который направляет результаты мутаций, такие как слияние ингибитора цитидиндезаминазы и урацилгликозилазы (UGI), может решить эту проблему ¹⁵ , но уменьшает количество мутаций, исследуемых в ходе эксперимента. Однако недавно опубликованные данные о слиянии cytidine deaminase-UGI показали, что они могут приводить к нецелевому редактированию in vivo с гораздо большей скоростью по сравнению с редакторами оснований аденина или нуклеазой Cas9 ^{44, 45} .Хотя в настоящее время нет высокопроизводительных данных о нецелевой активности Target-AID, данные, полученные на дрожжах в оригинальной публикации, предполагают гораздо более низкие уровни, чем те, которые недавно были описаны для клеток млекопитающих ¹⁵ . Недавно Садху, Блум и др. Исследовали эффекты преждевременных стоп-кодонов (PTC) в основных генах, используя метод конструирования вариантов с высокой пропускной способностью, который основан на гомологически направленной репарации с использованием мутантной репарационной матрицы ¹³ . Они заметили, что значительная часть PTC может переноситься, но только в пределах последних 30 кодонов белка.За пределами этого окна они не обнаружили связи между толерантностью к PTC и положением в кодирующей последовательности, чего мы также не наблюдали как для гРНК SGG, так и не-SGG (дополнительный рисунок 17A-B).

Мы предоставляем ключевые эмпирические данные о параметрах, зависящих от гРНК, которые можно использовать для оптимизации эффективности редактирования базы. Основываясь на наших результатах, выбор гРНК с высокой энергией связывания с их геномными мишенями и предпочтение тех, которые нацелены на некодирующую цепь, может увеличить вероятность высокой активности редактирования.Важно отметить, что наши наблюдения отличаются от того, что было сообщено для редактирования генома на основе Cas9. Вместо этого высокое связывание дуплекса gRNA РНК / ДНК было связано с более низкой эффективностью мутагенеза ⁴⁶ . Таким образом, наши данные подтверждают наблюдение, что параметры, связанные с редактированием Cas9, не могут быть легко перенесены в базовые редакторы ⁴⁷ . Кроме того, температура, при которой проводятся эксперименты, может влиять на эффективность для определенных гРНК с низкой энергией связывания дуплекса гРНК-ДНК и должна учитываться при разработке экспериментов по редактированию оснований в различных организмах ¹⁵ .Однако еще предстоит подтвердить, является ли обогащение определенных свойств гРНК, которые мы наблюдали, специфическими для Target-AID, или оно также может быть передано другим редакторам оснований, поскольку это может зависеть от ферментативных свойств этих белков. Получение больших парных наборов данных гРНК и результатов мутагенеза, аналогичных тем, которые доступны для редактирования генома Cas9 ²⁴ , позволит создать более совершенные модели для рационального прогнозирования активности по редактированию базы.

Область базового редактирования быстро развивается, постоянно разрабатываются новые инструменты.Одним из самых последних дополнений к этому быстрорастущему набору инструментов являются сконструированные ферменты Cas9 с расширенной специфичностью PAM ⁴⁸ , совместимость которых с базовыми редакторами уже доказана. Более гибкие требования PAM особенно полезны для базовых приложений редактирования, поскольку они увеличивают количество редактируемых сайтов, а также количество потенциальных гРНК на сайт, увеличивая шансы выбора оптимальных свойств и, следовательно, большую эффективность ²⁵ . Наш метод позволяет использовать экспериментальную шкалу, которая объединяет методы мутагенеза с насыщением и исследования нокаута в масштабе всего генома, облегчая текущий компромисс между мутационным разнообразием и количеством генов-мишеней для генерации новых биологических открытий.

Методы

Создание библиотеки gRNA для мутагенеза Target-AID основных генов дрожжей

Редактор оснований Target-AID имеет окно активности между основанием 15-20 в последовательности gRNA, начиная с PAM, и эффективность при эти различные положения были охарактеризованы в Nishida et al. 2016. Это позволило нам предсказать результаты мутаций для конкретной гРНК при условии, что количество редактируемых оснований в окне не слишком велико. Чтобы выбрать гРНК, мы проанализировали базу данных мишеней гРНК для S.cerevisiae референсных последовательностей генома (штамм S288c) ⁴⁹ и применили несколько критериев отбора. Поскольку скрининг должен был проводиться в штамме BY4741, все гРНК (уникальная последовательность семян, отсутствие сайта NAG) в базе данных были выровнены с эталонным геномом этого штамма с использованием Bowtie ⁵⁰ . Для последующих этапов сохраняли только гРНК с одним точным выравниванием. Чтобы выбрать гРНК, поддающиеся редактированию базы Target-AID, мы выбрали гРНК с цитозинами в пределах окна максимальной активности редактора (позиции от -17 до -19, начиная с PAM).Чтобы ограничить общее количество возможных мутационных результатов, были удалены gRNA с тремя цитозинами в пределах окна, а также с двумя цитозинами в положениях с наивысшей активностью. Затем мы отфильтровали любую гРНК, содержащую сайт рестрикции BsaI, чтобы предотвратить ошибки на этапе клонирования библиотеки.

Список основных генов (n = 1156) ^{3, 4} был использован для различения гРНК, нацеленных на основные или второстепенные гены (получено из http: //www-sequence.stanford.edu / group / yeast_deletion_project / Essential_ORFs.txt). Среди несущественных генов данные Qian et al. 2012 ⁵¹ был использован для создания категорий фитнес-эффектов. Если оценка пригодности (усредненная по средам и повторам) гена была ниже 0,75, это относилось к категории «сильное влияние» на приспособленность. Мы исключили гены ауксотрофных маркеров, а также CAN1 , LYP1 и FCY1 , поскольку они могут использоваться в качестве маркеров совместной селекции ²³ . Делеции генов со средней оценкой пригодности от 0.999 и 1.001 были отнесены к категории «не оказывающих заметного влияния» на приспособленность. Мы выбрали gRNAs, нацеленные на основные и высокоэффективные гены, а также gRNAs, нацеленные на набор из 38 случайно выбранных генов без эффекта. Чтобы еще больше ограничить пространство исследуемых gRNAs, были выбраны только gRNAs, отображающие от 0,5 ^th процентов до 75 ^th процентов кодирующих последовательностей. Мы также добавили gRNAs, нацеленные на все известные интроны дрожжей (база данных Ares lab 4.3) ⁵² и предполагаемые нефункциональные пептиды ⁵³ , выбранные с той же стратегией, за исключением ограничений на положение gRNA в интересующей последовательности.В результате был получен набор из 39 989 гРНК: свойства библиотеки суммированы на дополнительном рисунке 1. Чтобы присвоить оценку риска совместного редактирования каждой гРНК, мы определили четыре категории, используя состав последовательности расширенного окна активности, показанный в таблице 1.

Конструирование библиотеки

Плазмиды, олигонуклеотиды и среды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных таблицах 6, 7 и 8 соответственно. Олиго-пул синтезировали в Arbor Biosciences (Мичиган, США) и клонировали в вектор pDYSCKO с использованием Golden Gate Assembly (New England Biolabs, Массачусетс, США) со следующими параметрами реакции:

Смесь для лигирования трансформировали в E.coli , штамм MC1061 ([ araD139 ] _{B / r} Δ (araA-leu) 7697 Δ lacX74 galK16 galE15 (GalS) λ -e14-mcrA0 relA1 rpsL -e14-mcrA0 relA1 rpsL (strcR) SPO ) ⁵⁴ с использованием стандартного протокола химической трансформации и высевают на селективную среду для ампициллина для отбора трансформантов. Последовательные разведения клеток после разрастания высевали и затем использовали для расчета общего числа клонов, полученных в результате реакции клонирования. Контроль качества сборки осуществляли путем секвенирования по Сэнгеру ~ 10 клонов на реакцию сборки.Клетки соскребали с планшетов, добавляя ~ 5 мл стерильной воды, инкубируя несколько минут при комнатной температуре, а затем используя стеклянную лопаточку для ресуспендирования колоний. Затем ресуспендированные планшеты объединяли в одну колбу для каждой реакции, которую затем использовали для получения глицериновых запасов библиотеки и осадка клеток для экстракции плазмиды. Набор Qiagen Midi-Prep (Qiagen, Германия) использовали для извлечения плазмидной ДНК из осадка клеток, следуя инструкциям производителя. Затем измеряли концентрацию ДНК в каждом элюате, используя NanoDrop (Thermofisher, Массачусетс, США), и собирали нормализованную мастер-библиотеку для трансформации дрожжей путем объединения равных количеств каждого пула сборки.

Время редактирования базы и подготовка библиотеки для глубокого секвенирования.

Клетки котрансформировали pKN1252 и плазмидой pDYSCKO, несущей интересующую гРНК, с использованием протокола, описанного ниже для крупномасштабного эксперимента. Планшеты с трансформантами соскабливали, добавляя ~ 5 мл стерильной воды, инкубируя несколько минут при комнатной температуре, а затем используя стеклянную лопаточку для ресуспендирования колоний. Ресуспендированные клетки (один пул на направляющую) использовали для инокуляции двух повторных культур на направляющую.Клетки прошли тот же протокол индукции, что и в крупномасштабном эксперименте, но уменьшены до 24-х глубоких лунок (см. Дополнительные рисунки 3 и 7). Используемые объемы составляли: 3 мл для исходной культуры SC-UL + глюкоза, 4 мл для стадии SC-UL + глицерин, 3 мл для стадии SC-UL + галактоза и 3 мл для стадии совместного отбора жидкого канаванина. . В конце стадии индукции галактозы 100 мкл 1/2000 разведения каждой лунки высевали на твердую среду SC-ULR + канаванин для получения редактируемых выживших колоний.При переключении среды с глицерином на галактозу осадок с OD ~ 1 был взят путем вращения клеток при 13 200 об / мин и удаления среды. Осадки клеток затем хранили при -80 ° C для последующей экстракции ДНК. Тот же метод использовали для отбора проб ~ 1 ОП при Т = 6 часов в галактозе, ~ 2 ОП при Т = 12 часов в галактозе и ~ 3 ОП в конце совместного отбора канаванина. Планшеты с выбранными колониями (отредактированными по локусу CAN1) замачивали в воде и соскребали, и 1,4 мл полученной суспензии клеток отбирали и хранили.

Геномную ДНК экстрагировали из осадка клеток с использованием стандартного фенол-хлороформного метода из каждого образца ⁵⁵ и количественно оценивали с помощью NanoDrop (Thermo fisher, Массачусетс, США). Для каждого образца мы стремились секвенировать как целевой сайт редактирования, так и сайт редактирования с совместным выбором CAN1 и . Чтобы мультиплексировать 240 образцов в одной библиотеке секвенирования, мы использовали метод ПЦР с индексированием ряд-столбцы-планшеты (RCP-PCR) ⁵⁶ . Вкратце, каждый целевой локус амплифицировали из геномной ДНК и к каждому концу ампликона добавляли универсальные адаптерные последовательности.Разведение полученного продукта 1/2500 затем использовали в качестве матрицы с набором праймеров 10 (строки) на 12 (столбец), используемых для индексации каждого образца во второй реакции ПЦР. Затем все образцы для одного и того же локуса были объединены и нормализованы в соответствии с интенсивностью полосы геля электрофореза, а затем очищены с использованием магнитных шариков. Затем использовали третью и последнюю реакцию ПЦР на очищенных пулах для добавления индексов планшета и адаптеров Illumina: эту реакцию проводили в четырех повторностях, и продукты из четырех реакций объединяли вместе для очистки.Секвенирование выполняли с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v3 на Illumina MiSeq в течение 600 циклов (платформа для секвенирования IBIS, Université Laval).

После секвенирования образцы были демультиплексированы с использованием специального сценария Python, при этом считывания были разделены на четыре части (штрих-код планшета вперед, штрих-код строки, штрих-код столбца и штрих-код планшета обратный). После демультиплексирования прямое и обратное чтение были объединены с использованием программного обеспечения PANDA-Seq ⁵⁷ . Затем считанные данные были сопоставлены с последовательностями ссылочного локуса с использованием программного обеспечения Needle от EMBOSS ⁵⁸ .Затем был использован специальный сценарий для анализа сопоставлений и извлечения информации о генотипе для каждого считывания. Записи секвенирования для эксперимента по глубокому секвенированию редактирования оснований были депонированы в NCBI SRA под номером доступа PRJNA552472.

Трансформация библиотеки в дрожжах

Компетентные BY4741 ( MATa his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0 ) клетки сначала трансформировали pKN1252 (p315-GalL-Target-AID ) плазмиды с использованием стандартного метода с ацетатом лития.Трансформанты отбирали путем посева клеток на SC-L. После 48 часов роста несколько колоний использовали для инокуляции заквасочной жидкой культуры для получения компетентных клеток с использованием стандартного протокола с ацетатом лития ⁵⁹ : объем культуры 200 мл использовали для создания достаточного количества компетентных клеток для массовой трансформации. Крупномасштабную трансформацию библиотеки проводили путем объединения 40 реакций трансформации, выполненных с 40 мкл компетентных клеток и 5 мкл библиотеки плазмид (240 нг / мкл) после стадии роста, и высева аликвот по 100 мкл на SC-UL: клетки затем позволяли расти при 30 ° С в течение 48 ч.Серийное разведение выделенных клеток 1/1000 помещали в 5 повторов и использовали для расчета количества полученных трансформантов. Общее количество трансформантов достигло 3,48 × 10 ⁶ КОЕ, что соответствует примерно 100-кратному охвату пула плазмид.

Мутагенез Target-AID и конкурентный скрининг

Протокол мутагенеза представляет собой расширенную версию нашего ранее опубликованного метода ²³ и показан на дополнительном рисунке 7. Трансформанты соскабливали, разливая 5 мл стерильной воды на чашках и затем ресуспендируя клетки с использованием грабли для стекла.Все планшеты объединяли в одной колбе, и OD ресуспендирования дрожжей измеряли с использованием планшет-ридера Tecan Infinite F200 (Tecan, Швейцария). Гранулы, соответствующие примерно 6 x 10 ⁸ клеток, дважды промывали SC-UL без источника углерода, а затем использовали для инокуляции 100 мл SC-UL + 2% культуры глюкозы при 0,6 OD два раза для создания реплик A и B. Клеткам давали возможность расти в течение 8 часов, после чего осаждали 1 × 10 ⁹ клеток и использовали для инокуляции 100 мл культуры SC-UL + 5% глицерина.Через 24 часа осаждали 5 × 10 ⁸ клеток и помещали либо в SC-UL + 5% галактозу для мутагенеза, либо в SC-UL + 5% глюкозу для фиктивного контроля индукции. Экспрессию Target-AID (из pKN1252) индуцировали в течение 12 часов перед осаждением 1 × 10 ⁸ клеток и культуры совместного отбора в мкг / мл в SC-ULR. После 16 часов инкубации 5 x 10 ⁷ клеток каждой культуры использовали для инокуляции 100 мл SC-UR, которые выращивали в течение 12 часов, прежде чем 5 x 10 ⁷ клеток использовали для инокуляции последних 100 мл SC- Культуру UR, которую выращивали еще 12 часов.Осадки клеток промывали стерильной водой между каждым этапом, и все инкубации происходили при 30 ° C при перемешивании. ~ 2 × 10 ⁷ клеток отбирали для экстракции плазмидной ДНК в конце каждого этапа мутагенеза и конкурентного скрининга.

Экстракция ДНК плазмиды дрожжей

ДНК плазмиды дрожжей экстрагировали с помощью мини-набора плазмидных дрожжей ChargeSwitch (Invitrogen, Калифорния, США), следуя протоколу производителя с небольшими изменениями: Зимолаза 4000 Ед / мл (Zymo Research, Калифорния, США) была использовали вместо литиказы, и клетки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, одну минуту при -80 ° C, а затем инкубировали еще 15 минут при комнатной температуре перед стадией лизиса.Плазмидную ДНК элюировали 70 мкл (10 мМ Трис-HCl, pH 8,5) и хранили при -20 ° C для использования в приготовлении библиотеки.

Подготовка секвенирования библиотеки нового поколения

Библиотеки были подготовлены с использованием двух этапов ПЦР-амплификации, одна для амплификации области gRNA пула плазмид pDSYCKO, а вторая для добавления штрих-кодов образцов, а также последовательностей Illumina p5 и p7 ⁶⁰ . Олигонуклеотиды для приготовления библиотеки показаны в первой части таблицы олигонуклеотидов. Условия реакции для первой ПЦР были следующими:

Протокол термоциклера:

Полученный продукт проверяли на 2% агарозном геле, окрашенном Midori Green Advance (Nippon Genetics, Япония), а затем экстрагировали и очищали с помощью FastGene Gel. / Набор для экстракции ПЦР (Nippon Genetics, Япония).Очищенные продукты использовали в качестве матрицы для второй реакции ПЦР при следующих условиях:

Протокол термоциклера:

Продукты ПЦР проверяли на 2% агарозном геле, окрашенном Midori Green Advance (Nippon Genetics, Япония), а затем в геле. -экстрагированы и очищены с использованием набора FastGene Gel / PCR Extraction Kit (Nippon Genetics, Япония). Контроль качества и количественная оценка библиотеки выполнялись с использованием набора для количественной оценки библиотеки KAPA для платформ Illumina (Kapa Biosystems, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя.Затем библиотеки запускались на одной дорожке на HiSeq 2500 (Illumina, Калифорния, США) с парным концом 150 пар оснований в быстром режиме.

Анализ данных секвенирования на большом экране

Пользовательские скрипты Python, используемые для анализа, доступны на github (https://github.com/landrylaboratory), а используемые пакеты и программное обеспечение представлены в дополнительной таблице 9. Необработанные файлы секвенирования депонированы в NCBI SRA, инвентарный номер PRJNA552472. Вкратце, считывания были разделены на три подпоследовательности для выравнивания: штрих-код P5, gRNA и штрих-код P7.Каждый из них был выровнен с использованием Bowtie ⁵⁰ с искусственным эталонным геномом, содержащим либо штрих-коды, либо последовательности гРНК, фланкированные общими последовательностями ампликонов. Последовательности гРНК выровнены с допуском 0 или 1 несовпадения, и положение и тип несовпадения были сохранены. Информация о штрих-коде и выравнивании гРНК для каждого считывания сохранялась и объединялась для создания счетчика штрих-кода для каждой таблицы библиотеки, списка несоответствий в выравнивании для каждой гРНК в каждой библиотеке, а также типов несоответствий и количества для одной и той же гРНК во всех библиотеках.

гРНК, отсутствующих более чем в половине библиотек (4446 из 39 989), были исключены из анализа перед расчетами численности гРНК.

Обнаружение мутаций с высокими эффектами приспособленности

В экспериментах по конкурентному секвенированию штрих-кода используются штрих-коды ДНК для измерения относительной численности множества различных субпопуляций клеток, выращенных в одном пуле (Robinson et al. 2014). Поскольку каждая гРНК связана со своими возможными результатами мутагенеза, мы можем использовать относительное количество гРНК для обнаружения мутаций со значительными эффектами приспособленности.Для этого журнал ₂ относительной численности штрих-кода после мутагенеза сравнивается с его численностью в конце экрана: Для каждой гРНК измеренный эффект приспособленности является продуктом влияния результатов мутаций на рост и скорости мутаций в субпопуляции клеток, несущих эту конкретную гРНК. Относительные подсчеты также будут изменяться стохастически из-за различий в охвате секвенированием в зависимости от момента времени и репликации. Чтобы уменьшить влияние этих эффектов, минимальное количество считываний в конце этапа индукции галактозы использовалось для фильтрации гРНК с низким содержанием.Мы обнаружили, что минимальный порог чтения n = 54 обеспечивает хороший компромисс между количеством gRNA, подходящих для анализа, и межповторной корреляцией.

Чтобы получить эталонное распределение вариации численности для гРНК, мы аппроксимируем нормальное распределение Δlog2 z-балльное распределение гРНК между началом эксперимента (временная точка глюкозы на дополнительном рисунке 9) и концом фиктивной точки времени индукции глюкозы. (n = 7875 значений). Имитация индукции повторяет момент времени индукции галактозы, но с использованием глюкозы в качестве единственного источника углерода, так что Target-AID не выражается.Используя это эталонное распределение, мы рассчитали z-показатель для каждой гРНК во время конкурентного эксперимента независимо для обоих повторов. Затем мы усреднили z-баллы между повторами. Мы установили порог значимости, такой как то, что все gRNAs в z-значениях, для которых оценочная частота ложных обнаружений ∼5% и ложноположительные результаты ∼0,2%, считаются GNE (дополнительные рисунки 9 B и C).

Анализы комплементации

Эксперименты проводили на гетерозиготных делеционных мутантах из набора гетерозиготных делеционных штаммов проекта YKO (Dharmacon, Colorado, USA).Для каждого гена одну колонию, выделенную из глицерина, использовали для получения компетентных клеток с использованием ранее описанного протокола с ацетатом лития ⁵⁹ . Для создания мутантных аллелей интересующих генов мы выполнили сайт-направленный мутагенез на соответствующей плазмиде коллекции MoBY ²⁷ . Эти центромерные плазмиды кодируют интересующий дрожжевой ген под контролем их природных промоторов и терминаторов. Реакции мутагенеза проводили со следующей реакционной схемой:

Протокол термоциклера:

После амплификации продукт мутагенеза расщепляли DpnI в течение 2 часов при 37 ° C и 5 мкл трансформировали в E.coli штамм BW23474 (F-, Δ (argF-lac) 169 , Δ uidA4 :: pir-116 , recA1 , rpoS396 (Am) , endA9 (del-ins) :: FRT , rph-1 , hsdR514 , rob-1 , creC510 ) ⁶¹ . Трансформанты высевали на 2YT + Kan + Chlo и выращивали при 37 ° C в течение ночи. Затем плазмидную ДНК выделяли из клонов и отправляли на секвенирование по Сэнгеру (платформа для секвенирования CHUL, Университет Лаваль, Квебек, Канада) для подтверждения успеха мутагенеза.

Компетентные клетки генов-мишеней трансформировали соответствующими мутантными плазмидами, а также исходной плазмидой, несущей ген дикого типа и пустой вектор ⁶² , и трансформанты отбирали путем посева на SC-U (MSG). Затем несколько независимых колоний на одну трансформацию помещали в среду для споруляции до тех пор, пока споруляция не могла быть подтверждена микроскопией. Для тетрадной диссекции клетки ресуспендировали в 100 мкл 20Т зимолиазы (разведение в воде 200 мг / мл) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в 50 мкл 1M сорбита перед нанесением штрихов на планшет с уровнем YPD. Все разрезы выполнялись с использованием микроскопа Singer SporePlay (Singer Instruments, Великобритания). Фотографии планшетов были сделаны после пяти дней инкубации при комнатной температуре, за исключением теста комплементации плазмиды RAP1, для которого фотография была сделана через три дня. Изображения показаны в дополнительном файле изображения 1.

для подтверждения в

Поскольку коллекционная плазмида MoBY для RAP1 не может полностью дополнить делецию гена (дополнительный файл изображения 1), мы вместо этого выполнили подтверждения путем инженерных мутаций диплоида. штамм для создания гетерозиготных мутантов. RAP1 был сначала помечен модифицированной версией фрагмента DHFR F [1,2] (первая половина) фермента mDHFR ⁶³ . Кассету mDHFR [1,2] -FLAG амплифицировали с использованием ген-специфичных праймеров и ранее описанных параметров реакции ⁶³ . Клетки трансформировали с помощью кассеты, используя ранее описанный протокол трансформации, и высевали на YPD + Nourseothricine (YPD + Nat в таблице сред). Положительные клоны идентифицировали с помощью ПЦР колоний, а успешное слияние фрагментов подтверждали секвенированием по Сэнгеру (платформа для секвенирования CHUL).Затем мы скрестили подтвержденные клоны со штаммом Y8205 ( Mat α can1 :: STE2pr-his5 lyp1 :: STE3prLEU2 Δ ura3 Δ his3 Δ leu2 , любезно подаренный Чарли Буном) путем инокуляции 4 мл YPD. культивирование с ночными заквасочными культурами обоих штаммов и дать культуре вырасти в течение ночи. Затем клетки наносили штрихами на YPD + Nat и диплоидные клетки идентифицировали с помощью ПЦР колоний с использованием диагностических праймеров типа спаривания ⁶⁴ .

Для создания мутантов с гетерозиготной делецией целевого гена мы амплифицировали модифицированную версию кассет URA3 , на которую затем можно было нацелить систему CRISPR-Cas9 для интеграции представляющих интерес мутаций с использованием гомологичной рекомбинации в целевом локусе.Используемые нами олигонуклеотиды отличаются от обычно используемых тем, что они амплифицируют кассету без двух сайтов LoxP, присутствующих на обоих концах. Мы обнаружили, что необходимо удалить эти сайты, поскольку один общий результат мутации после введения двухцепочечного разрыва в кассете URA3 представляет собой рекомбинацию между сайтами LoxP без интеграции донорской ДНК в целевой локус. Эти модифицированные кассеты рекомбинируют с ДНК выше целевого гена на одном конце и слияния mDHFR F [1,2] на другом, гарантируя, что гетерозиготная делеция всегда выполняется в локусе, который уже помечен.Кассеты трансформировали с использованием стандартного метода с ацетатом лития, и клетки высевали на селективную среду SC-U (MSG). Затем гетерозиготные делеционные мутанты подтверждали с помощью ПЦР колоний.

CRISPR-Cas9 опосредованное включение целевых мутаций

Мутантные аллели целевых генов были амплифицированы в два фрагмента с использованием матричной ДНК из штамма, меченного гаплоидом (см. Дополнительный рисунок 14). Затем два фрагмента, несущие мутации, были слиты вместе с помощью второго раунда ПЦР, чтобы сформировать окончательную донорскую ДНК.Затем эту ДНК совместно трансформировали плазмидой, несущей Cas9, и гРНК, нацеленной на кассету URA3, для HDR-опосредованного редактирования с использованием стандартного протокола ⁶⁵ . Затем клоны подвергали скринингу с помощью ПЦР для проверки донорской ДНК и интеграции мутации в целевом локусе. Целевую область RAP1 затем секвенировали по Сэнгеру (платформа для секвенирования CHUL, Univesité Laval, Квебек, Канада) для подтверждения присутствия представляющей интерес мутации. Гетерозиготные мутанты спорулировали на твердой среде до тех пор, пока споруляция не могла быть подтверждена микроскопией с использованием того же протокола, описанного ранее.Затем планшеты помещали в реплики на среду YPD + Nat, и снимки делали через пять дней при комнатной температуре (дополнительный файл изображений 2).

Измерения скорости эволюции и обилия вариантов белка

Скорости эволюции были рассчитаны с использованием программного обеспечения Rate4site ⁶⁶ с использованием нескольких выравниваний последовательностей и филогении из PhylomeDB V4 ⁶⁷ в качестве входных данных и с использованием исходных рассчитанных скоростей в качестве выходных данных. Данные о вариантах были собраны с использованием данных проекта 1002 Yeast Genome Project (http: // 1002genomes.u-strasbg.fr/files/allReferenceGenesWithSNPsAndIndelsInferred.tar.gz). Последовательность, кодирующая штамм-специфический белок, выравнивали с последовательностью S288c с использованием Fastx36 ⁶⁸ со следующими параметрами: fastx36 -p -s -VT10 -T 6 -m 10 -n -3 querymultifasta.fasta ref_orf.db 12 \> fasta_out . Затем выравнивания были проанализированы с помощью специального скрипта Python для выявления вариантов. Обилие вариантов измерялось как количество штаммов в наборе данных, в которых был обнаружен конкретный вариант. Если кодирующая последовательность содержала неоднозначные нуклеотиды (например,: R или Y), отдельные кодирующие последовательности были созданы для каждой возможности, и каждый возможный вариант рассматривался как отдельный случай.

Анализ свойств гРНК, генерирующих стоп-кодоны

Для анализа последовательности и свойств мишеней гРНК, индуцирующих создание стоп-кодонов, были собраны данные из нескольких источников. Для каждого целевого гена длина и хромосомная цепь были получены из базы данных генома Saccharomyces с использованием интерфейса запросов Yeastmine ⁶⁹ .Расстояние до центромеры было получено путем вычисления минимального расстояния между началом гена и одним концом координат центромеры. РНК: температуру плавления дуплекса ДНК последовательности гРНК с целевой геномной ДНК рассчитывали с использованием модуля MeltingTemp от Biopython ⁷⁰ , который использует значения, взятые из Sugimoto et al ⁷¹ . Корреляцию между температурами плавления дуплекса гРНК / ДНК оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена.

Анализ ресурсов прогнозирования эффектов вариантов и обогащение GO

Все данные прогнозирования, кроме оценок Envision, были извлечены из агрегированных данных базы данных Mutfunc ³¹ .Предварительно вычисленные значения были загружены непосредственно с FTP-сервера (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/mutfunc/mutfunc_v1/yeast/). Эта база данных включает предварительно вычисленные оценки SIFT для 5498 дрожжевых белков, а также прогнозируемые значения ddG вариантов, основанные на структуре белка (n = 1057), моделях гомологии (n = 1703) и интерфейсах взаимодействия белок-белок (n = 1109). Мутации с ΔΔ G> 1 считаются дестабилизирующими.

Предварительно вычисленные значения из Envision ² были загружены непосредственно с веб-сайта базы данных (https: // envision.gs.washington.edu/shiny/envision_new/, файл yeast_predicted_2017-03-12.csv). Этот файл содержал 34857830 прогнозов эффектов мутации, распределенных по 4011 генам. Распределение оценок Envision для генов, намеченных в эксперименте, которые включены в базу данных, показано на дополнительном рисунке 12.

Мы загрузили базу данных Uniprot для генов дрожжей (запрос: uniprot-proteome_UP000002311) с аннотациями, охватывающими следующие свойства: Металл связывание, связывание нуклеотидов, сайт, связывание ДНК, связывание кальция, сайт связывания, активный сайт, мотив.Мы обнаружили, что 6295 гРНК нацелены на гены, которые имеют аннотации в Uniprot, из которых 519 были GNE (ratioAll = 0,0749). Статистическое обогащение рассчитывали с использованием этого набора гРНК в качестве эталонной популяции. Обогащение генов проводили с помощью инструмента анализа списка генов PANTHER ⁷² . Список генов, для которых были обнаружены 2 или более GNE, был протестирован на обогащение по всем генам, на которые нацелена библиотека, с использованием точного критерия Фишера и расчетов уровня ложного обнаружения. Использовались следующие наборы данных Gene Ontology: выполнение молекулярной функции GO, завершение биологического процесса GO и завершение клеточного компонента GO.

Методы распределения дисков

• Ссылка: SGG, глава 12, с акцентом на раздел 12.4

Примеры файловых систем

• UFS: файловая система Unix Вы можете прочитать об этом с

   man 4 df_ufs 

  Вы можете увидеть информацию о текущем состоянии файловой системы с помощью

   df -g 

• XFS: Используется 64-разрядная высокопроизводительная журналируемая файловая система. IRIX для дисков.IRIX — это версия UNIX от Silicon Graphics.
• FAT: стандартная файловая система DOS, также доступна в OS / 2 и Windows
• FAT32: более новая версия FAT с 32-битными номерами блоков (может адресовать до 4+ миллиардов блоков)
• NTFS: файловая система Windows NT, также доступна в Windows 2000
• High Sierra: файловая система CD-ROM, стандартизованная для большинства CD-ROM.
• NFS: Сетевая файловая система: делает файловые системы доступными для других компьютеров в UNIX. Не файловая система в том же смысле, что и другие.

Диск

• моделируют адреса физического диска с адресами блоков
  • адрес блока — это просто целое число, указывающее, какой из блоков он
  • адрес блока также называется номером блока
  • обычно каждый адрес блока соответствует ровно одному идентификатору сектора, но иногда адрес блока соответствует нескольким идентификаторам секторов.
• Уровень ввода-вывода ОС переводит адреса дисков, выраженные как комбинация # привода, # велосипедиста, # дорожки и # сектора, в идентификаторы секторов (и, если необходимо, номера блоков).
• использовать диск для:
  • файловая система
  • пространство подкачки (управляется как часть файловой системы в UNIX)
• общая проблема: как организовать место на диске?

Методы распределения дисков

а)

непрерывное выделение

• каждый файл занимает набор последовательных адресов на диске
• каждая запись каталога содержит:
  • имя файла
  • начальный адрес первого блока
  • адрес блока = идентификатор сектора (например,г., блок = 4K)
  • длина в блоках
• обычная проблема распределения динамической памяти
  • использовать алгоритмы первого, наилучшего или наихудшего соответствия для управления хранилищем
• если файл может увеличиваться в размере, либо
  • не оставляйте лишнего места и скопируйте файл в другое место, если он расширяется
  • оставить лишнее место

б)

связанное размещение

• каждый блок данных содержит адрес следующего блока в файле
• каждая запись каталога содержит:
  • имя файла
  • адрес блока : указатель на первый блок
  • иногда, также есть указатель на последний блок (добавление в конец файла намного быстрее, если использовать этот указатель)

• вид связанного списка

c)

индексированное размещение

• хранить все указатели вместе в индексной таблице
  • индексная таблица хранится в нескольких индексных блоков
  • предположим, что индексная таблица была загружен в основную память

i)

все файлы в одном индексе

В индексе есть одна запись для каждого блока на диске.

• лучше, чем связанное распределение, если мы хотим найти конкретное смещение файла, потому что многие ссылки хранятся вместе, а не каждый в отдельном блоке
• SGG называет эту организацию « связанной » схемой, но я называю это « индексированная » схема, потому что индекс хранится в основной памяти.
• проблема: индекс слишком велик для размещения в основной памяти для больших дисков
  • FAT может стать очень большим, и нам, возможно, придется хранить FAT на диске, что увеличит время доступа
  • эл.г., диск 500 Мб с блоками по 1 Кб = 4 байта * 500 Кб = 2 Мб записей

ii)

отдельный индекс для каждого файла

• индексный блок дает указатели на блоки данных, которые могут быть разбросаны
• прямой доступ (вычисленное смещение)

а)

один индексный блок для каждого файла (предполагается, что индекс является непрерывным)

б)

связанный список индексных блоков для каждого файла

в)

многоуровневый индекс

г)

комбинированная схема (схема i-node), используемая в UNIX

Пример методов распределения диска
Вопрос, аналогичный (Упражнение 12.1 в SGG или 11,1 в S&G)

Рассмотрим файл, состоящий на данный момент из 150 блоков. Предположим, что блок управления файлом (и индексный блок в случае индексированного распределение) уже находится в памяти. Подсчитайте, сколько операций ввода-вывода на диске требуются для непрерывного, связанного и индексированного (одноуровневого) распределения стратегии, если для одного блока выполняются следующие условия. В случае непрерывного распределения предположим, что нет места для расти вначале, но есть куда расти в конце.Предполагать что добавляемая блочная информация хранится в памяти.

Предположения :

• Каждая операция ввода-вывода читает или записывает целый блок.
• Для связанного размещения таблица размещения файлов (FAT) не используется, т.е. в памяти находится только адрес начального блока.
• Блоки пронумерованы от 1 до 150, а текущие позиции эти блоки также пронумерованы от 1 до 150.
• Вся подготовка блока (включая ввод данных и любых значение ссылки) выполняется в основной памяти, а затем записывается блок на диск за одну операцию записи.
• Блок управления файлом не нужно записывать на диск после изменение (это типично, когда над файлом выполняется много операций).
• Для каждого файла требуется не более одного индексного блока, и он не имеет для записи на диск после изменения.
• Для связанного распределения предположим, что операции ввода-вывода не требуются добавить освобожденный блок в список свободных.

а)

Блок добавлен посередине:

Смежный: Предположим, что в середине означает после блока 75 и перед блоком 76.Перемещаем последние 75 блоков на одну позицию вниз а затем напишите в новом блоке.

Операции ввода / вывода

Связано: мы не можем найти блок 75, не пройдя связанный список хранится в первых 74 блоках данных. Итак, сначала мы прочтите эти 74 блока. Затем читаем блок 75, копируем его ссылка на новый блок (в основной памяти), обновить ссылку блока 75 чтобы указать на новый блок, запишите блок 75, запишите новый блок.

74r + 1r + 1w + 1w = 75r + 2w = 77 операций ввода-вывода
block75 новый

Индексировано: обновить индекс в основной памяти.Напишите новый блок.

1w = 1 Операция ввода / вывода

б)

Блок снимается с начала.

Смежный: просто измените начальный адрес на 2.

0 операций ввода-вывода

Связано: прочтите блок 1 и измените начальный адрес на ссылку хранится в этом блоке.

1r = 1 Операция ввода / вывода

Проиндексировано: просто удалите адрес блока из связанного списка. в индексном блоке.

0 операций ввода-вывода

Пример преобразования логических адресов в физические для файловых систем

Вопрос:

Рассмотрим файловую систему на диске, имеющую как логические, так и физические размеры блока 512 байт. Предположим, что информация о каждом файл уже находится в памяти. Для непрерывной стратегии ответь на эти вопросы:

а)

Каким образом выполняется преобразование логических адресов в физические в этом система? (Для индексированного распределения предположим, что файл всегда длиной менее 512 блоков.)

б)

Если мы сейчас находимся в логическом блоке 10 (последний доступный блок был блок 10) и хотите получить доступ к логическому блоку 4, сколько физических блоков надо читать с диска?

Отвечать:

Предположения: 1. Пусть L — логический адрес, а P — физический адрес. 2. Предположение в части (а) неверно. Разумнее просто предположите, что индекс достаточно мал, чтобы поместиться в один блок. Фактически, для файла размером 512 блоков, вероятно, потребуется более одного 512 байт. block, потому что для каждого адреса блока обычно требуется 3-4 байта.

(а) Обзор ЦП генерирует логический адрес L (относительное смещение в файле) и файловая система должна преобразовать его в физический адрес P (адрес диска представлен номером блока PB и смещением в этом блоке). Для удобства При расчете считаем, что блоки пронумерованы от 0. В любом подход, мы можем определить номер логического блока LB, разделив логический адрес L размером логического блока (здесь 512). Точно так же смещение, которое будет одинаковым для логических и физических адресов, поскольку размеры блоков идентичны, определяется применением модуля.Смещение одинаков во всех подходах.

 LB: = L div 512
        смещение: = L mod 512
 

Смежный: Предположим, что S — начальный адрес непрерывного сегмента. Тогда простой подход к отображению адреса:

 П = S + L
 

Если мы предпочитаем рассматривать уровень блока,

 ПБ = SB + LB
 

(b) Если мы сейчас находимся в логическом блоке 10 и хотим получить доступ логический блок 4 …

Смежный: мы просто перемещаем головку диска назад на 6 блоков (от от физического блока 10 к физическому блоку 4), потому что выделенное пространство к файлу непрерывно.Затем мы читаем блок 4, в сумме одно чтение.

Блоки типа файловой системы используют avail% use iuse ifree% iuse Mounted
/ dev / dsk / dks efs 7654152 27 4864093 36% 158252 647230 20% / u
 

                      7654152 Кб = всего места
 

27 Кб = используется
 
 

4864093 Кб = бесплатно
 
 

я использую = нет.используемых i-узлов = кол-во файлов
 
 

я свободен = лишние i-узлы
 
 

Каждый i-узел:

• описывает один файл
• учетная информация (биты владельца и защиты)
• предоставляет информацию об адресе для всех блоков в файле
  • прямые указатели на первые 10 блоков
  • косвенный указатель на блок, содержащий больше указателей
  • двойной косвенный указатель на блоки указателей
  • тройной непрямой
    • блок указателей на блоки указателей на блоки указателей к блокам данных

Пример расчета максимального размера файла

• Предположим, что есть 10 прямых указателей на блоки данных, 1 косвенный указатель, 1 двойной косвенный указатель и 1 тройной косвенный указатель
• Предположим, что размер блоков данных составляет 1024 байта = 1 КБ, т.е.е., BlockSize = 1Kb
• Предположим, что номера блоков представлены как 4-байтовые целые числа без знака, то есть BlockNumberSize = 4b
• Некоторые блоки данных используются как индексные блоки. 30 б = 16 Гб
• Максимальный размер файла: 16 ГБ + 64 МБ + 266 КБ

• Ссылка: см. Стр.165 Раздаточный материал Таненбаума

Родители английского медресе Аль-Хайр