Нобелевскую премию по медицине присудили за лекарства от малярии и глистов
Первая нобелевская премия 2015 года вручена за разработку новых методов лечения от малярии и глистов. Китайский биохимик Ту Юю создала новое лекарство, используя экстракт полыни, американец Уильям Кэмпбелл и японец Сатоси Омура применили бактерии, живущие в почве.
Сегодня были объявлены лауреаты Нобелевской премии 2015 года по медицине и физиологии. Половина премии (порядка $465 тыс.) присуждена Уильяму Кэмпбеллу и Сатоси Омуре за открытия новых методов лечения инфекций, вызываемых аскаридами (глистами). Вторая половина суммы — Юю Ту за ее открытия в области новых методов лечения малярии.
Как сказано на сайте Нобелевского комитета, глисты поражают треть населения Земли, но больше всего они распространены в Африке на территориях южнее Сахары, Южной Азии и Центральной и Южной Америке. Они вызывают речную слепоту (онхоцеркоз) и лимфатический филяриатоз. Первое заболевание приводит к слепоте из-за хронического воспаления роговицы, второе (им страдает более 100 млн человек) ведет к продолжающимся всю жизнь стигматизирующим и вызывающим инвалидность симптомам, включая элефантиаз (слоновья болезнь, лимфедема) и водянке мошонки. Малярия, в свою очередь, передается комарами: болезнь вызывается одноклеточными паразитами, которые внедряются в красные кровяные тельца, вызывая лихорадку, а в тяжелых случаях поражение мозга и смерть. Каждый год это заболевание уносит более 450 тыс. жизней.
Малярия традиционно лечилась хлорохином или хинином, однако успех лечения постоянно снижался, сказано в презентации комитета. К концу 1960-х годов усилия по искоренению малярии провалились и болезнь начала снова распространяться. Китайская исследовательница Ту Юю обратилась к традиционному траволечению для развития новых способов борьбы с малярией. Из большого списка лекарственных трав, используемых для лечения животных, она использовала экстракт однолетней полыни (Artemisia annua). Из него она впоследствии выделила активный компонент, который был назван Aremisinin. Он стал новым классом веществ, быстро убивающих паразитов малярии на ранней стадии развития. Это позволило значительно сократить смертность при заболевании малярией, подчеркнули в комитете.
В свою очередь, японский микробиолог Сатоси Омура изучал группу бактерий Stretomyces, живущих в почве и известных тем, что выделяют множество веществ с антибактериальными свойствами. Господин Омура выделил новые штаммы этих бактерий и успешно культивировал их у себя в лаборатории. Из многих тысяч различных культур он выбрал 50 наиболее перспективных для дальнейшего анализа их влияния на вредоносные микроорганизмы. Полученные культуры, в свою очередь, изучил американский эксперт в области паразитарной биологии Уильям Кэмпбелл. Он показал, что компонент одной из культур очень эффективен против паразитов домашних животных и домашнего скота. Биоактивное вещество было очищено и получило название Avermectin (впоследствии преобразовано в еще более эффективный Ivermectin). Позднее лекарство проверили на людях: оказалось, что средство эффективно уничтожает личинки паразитов. Сегодня это лекарство уже используется по всему миру. При использовании в комбинационной терапии вещество сокращает смертность на 20% в целом и на 30% у детей. Для Африки это означает спасение 100 тыс. жизней ежегодно.
«Лечение настолько успешно, что эти болезни оказались на грани совершенного исчезновения. Это станет веховым событием в медицинской истории человечества,— пояснили в Нобелевском комитете.— Малярией инфицируется примерно 200 млн человек ежегодно. После десятилетий относительно ограниченного прогресса в создании надежных лекарств от паразитов открытия лауреатов нынешнего года радикально изменили ситуацию. Совместный вклад Сатоси Омуры и Уильяма Кэмпбелла привел к созданию нового класса препарата. Эти два открытия дали человечеству два мощных новейших средства борьбы с этими изнурительными заболеваниями, которые поражают ежегодно миллионы человек».
Николай Зубов, Иван Буранов
За что нобелевскую премию по медицине мог получить ученый из России
Александр Руденский — один из главных претендентов на премию в категории «Достижения в области медицины» по прогнозу компании Thomson Reuters. С 2002 года ее аналитики предугадали 27 нобелевских лауреатов. Директор Людвиговского центра иммунотерапии рака в США, профессор Корнелльского университета Александр Руденский вместе с коллегами Итаном Шевачем и Шимоном Сакагучи совершил фундаментальные открытия относительно природы и назначения регуляторных клеток иммунной системы человека. Их достижение позволяет понять суть механизмов, из-за которых возникают аутоиммунные заболевания. Читайте подробнее
Бывший агент США уверяет, что Америка поставляет нам зараженные продукты
Более 80 процентов продуктов, товаров, удобрений и лекарств, ввозимых в Россию из США, заражены опасными паразитами. Об этом сообщил бывший сотрудник разведывательных служб Америки Эдвард Сноуден, нашедший убежище в нашей стране. Достоверность этой информации сейчас проверяют причастные службы. Тем не менее резонанс среди экспертов заявление Сноудена вызвало большой.
Внутри паразиты
Продовольственное эмбарго, которое Россия ввела в ответ на западные санкции, на самом деле не распространяется на ввоз из США мясной и рыбной
продукции, сельскохозяйственных товаров, снеков, безалкогольных
напитков, полуфабрикатов для ресторанов быстрого питания. И, по словам Сноудена, во всех этих продуктах содержится особая разновидность паразитов.
В доказательство своих слов Сноуден привел статистику смертности в России. В 87 процентах случаев главная причина — внутримозговое кровоизлияние, инсульт. За последние 20 лет это первая из причин смертности населения страны. Врачи ставят этот диагноз при любом нарушении работы мозга. А что реально послужило причиной, неизвестно. Вскрытие жертв этой «биологической» войны не производится.
Своя пища ближе
Российское сельское хозяйство, по утверждению Сноудена, тоже оказалось под угрозой. Якобы большая часть используемых удобрений, закупаемых в США, тоже заражена яйцами смертельно опасных паразитов.
— Америка понимает провальность своих действий на политической арене и готова использовать любые методы, чтобы хоть как-то поставить Россию на колени, — пояснил Сноуден. — Разложить ее изнутри в прямом смысле! Идет незримая война.
Это его заявление не на шутку обеспокоило ряд надзорных ведомств.
— Должна быть
проведена срочная тщательная проверка всех действующих точек сетей
быстрого питания для подтверждения слов господина Сноудена, — комментирует Валентин Покровский, директор ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора». — Граждане страны должны быть оповещены о возможной угрозе и по возможности полностью исключить из рациона вышеупомянутую продукцию. В качестве профилактических мер я настаиваю на употреблении антипаразитарных препаратов расширенного спектра действия. На сегодняшний день самой безопасной является новейшая разработка российских ученых-паразитологов под названием «NNN». Это добавка нового поколения. В ее рецептуре содержатся компоненты, способные бороться практически со всеми известными нам видами паразитов, а также выводящие из организма все продукты их жизнедеятельности. Только так вы сможете обезопасить себя и своих близких от возможной опасности.
— Я всегда интересуюсь, где произведена та или иная продукция, — поделилась нижегородский биолог Светлана Рожкова. — Стараюсь импортную вообще не покупать. Хотя, конечно, свежие фрукты и овощи в межсезонье все равно сплошь привозные. Терплю до начала лета, когда начинаются российские поставки. Да и все эти заморские фрукты-ягоды абсолютно безвкусные, и витаминов, я так подозреваю, там никаких нет. Мясную продукцию, яйца, молоко стабильно покупаю производства нижегородских предприятий. Выбираю товары известных брендов, дабы не нарваться на подделку или некачественную продукцию.
Все под контролем?
— Потоки товара регулируются бизнесом. Вряд ли кто-то специально будет заражать партию товара. Ведь она может оказаться и на внутреннем рынке, — рассуждает Асхат Каюмов, председатель совета Нижегородского общественного движения «Экологический центр «Дронт». — Или направиться в другое государство. А вообще, в теории любую продукцию можно заразить любой дрянью, и органы госконтроля вовсе не обязательно это заметят. Думаю, кто-то просто заинтересован раздуть и без того напряженные отношения между нашими государствами. Ведь почему к нам поставляли «ножки Буша»? Не из-за наличия в них стимуляторов и гормонов, а потому что в Америке их никто не покупал. Лежит, к примеру, на полке в магазине дешевый продукт. Нужно задуматься, а почему он дешевый. Вот вы, к примеру, всегда ли спрашиваете у продавцов таких товаров сертификат качества? А нужно спрашивать. И если что — сообщить в надзорные органы. Вообще же, есть морские паразиты, которые мигрируют по организму человека. Но они есть и в отечественной рыбной продукции и легко убиваются, пройдя термообработку. Конечно, если в Америке запретили какую-либо продукцию, ее действительно могут направить к нам. Только я не думаю, что это какая-либо сознательная диверсия.
— Предприятия пищевой и перерабатывающей промышленности не осуществляют ввоз сырья из США для последующего его использования при производстве своей продукции, — в свою очередь, сообщили «НН» в министерстве сельского хозяйства и продовольственных ресурсов Нижегородской области. — Предприятиями целенаправленно проводится работа по организации контроля качества входного сырья и готовой продукции. На крупных предприятиях области внедрены и сертифицированы система качества на соответствие требованиям ГОСТ Р ИСО 9001 и система менеджмента пищевой безопасности на основе принципов ХАССП. В рамках
функционирования сертифицированных систем проводятся плановые ежегодные
инспекционные контроли. Подтверждение сертификации независимыми
аккредитованными организациями выдаются каждые три года.
Ольга СИНИЧКИНА.
Фото Александра ВОЛОЖАНИНА.
Коллаж Дмитрия АНДРЕЕВА.
Анг. HACCP — Hazard Analysis and Critical Control Points, анализ рисков и критические точки контроля — система управления безопасностью пищевых продуктов, основная задача которой — обеспечение контроля на всех этапах производственного процесса. А также и при хранении и реализации продукции, то есть везде, где может возникнуть опасная ситуация, связанная с безопасностью потребителя.
Игорь ЗЮЗИН, и.о. начальника отдела ветеринарного надзора Управления Россельхознадзора по Нижегородской области и Республике Марий Эл:
— Продукты питания на территорию Нижегородской области из США в рамках прямых поставок (если таможенное оформление происходит на территории Нижегородской области) не поступают. Однако на протяжении последних десяти лет в ПАО «Международный аэропорт Нижний Новгород (Стригино)» привозится биологический материал (сперма и эмбрионы крупного рогатого скота), предназначенный для воспроизведения племенного стада на территории Российской Федерации.
Данный товар поступает в специальных криогенных контейнерах, имеет все необходимые разрешения Россельхознадзора, поступает по ветеринарным
сертификатам, гарантирующим получение племенного, полноценного,
здорового потомства крупного рогатого скота и, как следствие, получение
высококачественной молочной и мясной продукции. За все это время нарушений при ввозе биоматериала на территорию Нижегородской области из США не выявлено.
Now Foods, L-глутамин, 500 мг, 120 растительных капсул отзывы — Витамины и БАДы iHerb
Now Foods, L-глутамин, 500 мг, 120 растительных капсул отзывы — Витамины и БАДы iHerbКупить
Оценка:★★★★★ Отчичный витамин!Заказываю раз 5 точно, муж говорит, что идеальный глютамин! Верю!
Оценка:★★★★★ НормСейчас пью в антипаразитарной программе для заживления стенок кишечника. Побочек нет. 3 раза в день между едой
Оценка:★★★★★ СуперМне понравился препарат исчез дискомфорт в желудке , с кишечником все отлично как по часам ! Буду Брать ещё рекомендую !
Оценка:★★★★★ Принимаю для заживления стенок кишечника.Принимать между приемами пищи ( через 1,5 часа после еды или за час до) по 1 шт.Хорошая аминокислота, укрепляет иммунную систему, помогает при лечении кишечника, а также при лечении СРК. Мне очень понравилось. Я рекомендую! Если отзыв был полезен ставь ДА, Yes.
Оценка:★★★★★ Помог в борьбе с гастритомПринимала по капсуле только два месяца, и то пропускала дни и забывала. Причина покупки -слабый желудок, давний гастрит, частые вздутия, неприятные ощущения утром после подъема в районе груди. Все это я сезонно пролечивала таблетками. По рекомендации подруги приобрела глутамин. После глутамина, правда, еще приобрела концентрат алоэ и пью его до сих пор. И вот недавно, объевшись жжжжжирной пищи и пыхтя, вдруг вспомнила, как мучилась раньше и осознала, что давно не страдаю своими постоянными болячками желудка! Вдвойне приятно понимать, что достигнуто это без помощи синтетики (но и отказываться насовсем я от нее не собираюсь). Пока ттт, живем)
Оценка:★★★★★ Лицо чистоеВместе с D3 пила по назначению врача от прыщей.Не знаю, кто лучше отработал, но явно на шее и лице количество уменьшилось. Я бы даже сказала пропало. Иногда появляются, но не критично.ЖКТ восстанавливает
Оценка:★★★★★ Хороший товарОчень нужный препарат.Помогает
Оценка:★★★★ Пищеварение однозначно улучшилосьПродолжаю принимать. Дискомфорт после еды беспокоит гораздо режеБольше отзывов
Обзор
ЖУРНАЛ ИНФЕКТОЛОГИИ Том 11, № 2, 2019 23
2. Лейшманиоз. – Публикация ВОЗ. – № 375. – 2014.
3. Cергиев, В.П. Паразитарные болезни человека / В.П.
Cергиев, Ю.В. Лобзин, С.С. Козлов. – СПб.: Фолиант, 2011.
– 608 с.
4. Berman J.D. Human leishmaniasis: clinical, diagnostic
and chehemotherapeutic developments in the last 10 years.
Clin. Infect. Dis. 1997; 24:684-703.
5. Chakravarty J., Sundar S. Drug resistance in leishmani-
asis. J. Glob. Infect. Dis. 2010; 2(2):167-176.
6. Kunzler B. Cutaneous leishmaniasis: the efficacy of non-
antimony treatment in the austere environment. Using cryo-
therapy, thermotherapy and photodynamic therapy as an alter-
native method of treatment. J. Spec. Oper. Med. 2013; 13(4):40-
45.
7. Страчунский, Л.С. Практическое руководство по ан-
тиинфекционной терапии / Л.С. Страчунский, Ю.Б. Бело-
усов, С.Н. Козлов. – НИИАХ СГМА, 2007. – 420 с.
8. Savoia D. Recent updates and perspectives on leishmani-
asis. J Infect Dev Ctries. 2015 Jul 4;9(6):588-96.
9. Taheri A.R., Govonlo V.M., Nahidi Y. et al. Plasma lev-
els of interleukin-4 and interferon-γ in patients with chronic or
healed cutaneous leishmaniasis. Iran J. Basic Med. Sci. 2014;
Mar; 17 (3):216-219.
10. Valencia C., Arévalo J., Dujardin J.C. et al. Prediction
score for antimony treatment failure in patients with ulcerative
leishmaniasis lesions. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(6): e1656.
doi: 10.1371/journal.pntd.0001656. Epub 2012.
11. Шуйкина, Э.Е. Возможность антибиотикотерапии
при лейшманиозах / Э.Е. Шуйкина [и др]. // Мед. паразитол.
– 2009. – № 3, – С. 45–47.
12. Rezaei Riabi T., Sharifi I., Miramin Mohammadi A.,
Khamesipour A . et al. Evaluation of a Possible Synergistic Ef-
fect of Meglumine Antimoniate with Paromomycin, Miltefosine
or Allopurinol on in Vitro Susceptibility of Leishmania tropica
Resistant Isolate. Iran J Parasitol. 2013 Jul;8(3):396-401.
13. Barbosa J.F., de Figueiredo S.M., Monteiro F., et al. New
Approaches on Leishmaniasis Treatment and Prevention: A Re-
view on Recent Patents. Recent Pat. Endocr. Metab. Immune
Drug Discov. 2015 Sep 21.
14. Moreno E., Schwartz J., Fernandez C. et al. Nanopar-
ticles as multifunctional devices for the topical treatment of cu-
taneous leishmaniasis. Expert Opinion on Drug Delivery. 2014.
–Vol.11, N 4. – 579-597.
15. Croft S.L., Olliaro P. Leishmaniasis chemotherapy –
challenges and opportunities. Clin. Microbiol. Infect. 2011. 17
(10): 1478-1483.
16. Mock D.J., Hollenbaugh J.A., Daddacha W. et al. Leish-
mania induces surviuval, proliferation and elevated cellular
dNTP levels in human monocytes promoting acceleration pf
HIV-co-infection. PloS Pathog. 2012; 8(4):e1002635
17. Olliaro P., Vaillant M., Arana B. et al. Methodology
of clinical trials aimed at assessing interventions for cutane-
ous leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(3):e2130. doi:
10.1371/journal.pntd.0002130. Epub 2013 Mar 21.
18. Arimand R., Fard S., Saberi S., et al. Antigenic profile of
heat-killed versus thimerosal-treated Leishmania major using
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
Adv Biomed Res. 2015; 4: 128.
19. Matos I., Mizenina O., Lubkin A. et al. Targeting Leish-
mania major antigens to dendritic cells in vivo induces protec-
tive immunity. PLoS one, 2013; 8(6): e67453.
20. Tripathi P., Singh V., Naik S. Immune response to leish-
mania: paradox rather than paradigm. FEMS Immunol Med Mi-
crobiol 2007; 51: 229–242.
21. Reiner S.L., Locksley R.M. The regulation of immunity to
Leishmania major. Ann Rev Immunol. 1995; 13:151-177.
22. Sacks D., Noben-Trauth N. The immunology of suscep-
tibility and resistance to Leishmania major in mice. Nat Rev Im-
munol. 2002; 2: 845–858.
23. Scott P., Artis D., Uzonna J., Zaph C. The development
of effector and memory T cells in cutaneous leishmaniasis: the
implications for vaccine development// Immunol Rev. 2004;
201: 318–338.
24. Launois P., Louis J.A., Milon G. The fate and persistence
of Leishmania major in mice of different genetic backgrounds:
an example of exploitation of the immune system by intracel-
lular parasites. Parasitology. 1997; 115 Suppl: S25–S32
25. Costa D.L., Carregaro V., Lima-Júnior D.S., et al. BALB/c
mice infected with antimony treatment refractory isolate of
Leishmania braziliensis present severe lesions due to IL-4 pro-
duction. PLoS Negl Trop Dis. 2011 Mar 1;5(3):e965.
26. Lazarski Ch.A., Ford J., Katzman Sh.D. et al., IL-4 attenu-
ates Th2-associated chemokine expression and Th2 trafficking
to inflamed tissues and limits pathogen clearance. PloS One.
2013; 8 (8): e71949.
27. Schwarz T., Remet K., Nahrendorf W. et al. T-cell de-
rived IL-10 determines leishmaniasis disease outcome and is
suppressed by a dendritic cell based vaccine. PLOS Pathog.
2013; 9(56): e1003-476.2013).
28. Neumayr A.L., Morizot G., Visser L.G. et al. Clinical
aspects and management of cutaneous leishmaniasis in rheu-
matoid patients treated with INF-α antagonists. Travel Med. In-
fect. Dis. 2013; 11(6):412-420.
29. Lessa H.A., Machado P., Lima F. et al. Successful treat-
ment of refractory mucosal leishmaniasis with pentoxifylline
plus antimony. Am J Trop Med Hyg. 2001 Aug; 65(2):87-89.
30. Almeida R.P., Brito J., Machado P.R. et al. Successful
treatment of refractory cutaneous leishmaniasis with GM-CSF
and antimonials. Amer. J. Trop. Med. Hyg. 2005; 73(1): 79081.
31. Santos J.B., de Jesus A.R., Machado P.R. et al. Antimony
plus recombinant human granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor applied topically in low doses enhances
healing of cutaneous Leishmaniasis ulcers: a randomized,
double-blind, placebo-controlled study. J Infect Dis. 2004 Nov
15;190(10):1793-6. Epub 2004 Oct 18.
32. Alexander J, Bryson K. T helper (h) 1/Th3 and Leishma-
nia: paradox rather than paradigm. Immunol. Lett. 2005 Jun 15;
99(1):17-23.
33. Сastellano L.R., Filho D.C., Argiro L., Dessein H., Prato
A., Dessein A., et al. Th2/Th3 immune responses are associated
with active cutaneous Leishmaniasis and clinical cure is associ-
ated with strong interferon – gamma production. Hum immu-
nol. 2009; 99:17-23.
34. Choi B.S., Kropf P. Evaluation of T cell responses in heal-
ing and nonhealing Leishmaniasis reveals difference in T help-
er cell polarization ex vivo and vitro. Parasite Immunol. 2009;
31:199-209.
35. Harms G., Zwinngenberger K., Chahade A.K. et al. Ef-
fects of intradermal gamma-interferon in cutaneous leishmani-
asis. Lancet. 1989; 1(8650): 1287-1292.
36. Haas N., Hauptmann S., Paralikoudi D. et al. Interferon-
gamma treatment induces granulomatous tissue reactions in a
case of localized cutaneous leishmaniasis. Am. J. Dermatopa-
thol. 2002, Aug; 24 (4):319-323.
37. Ajdary S., Riazi–Rad F., Alihomommadian M.H. et al.
Immune response to Leishmania antigen in anthroponotic cuta-
neous leishmaniasis. Parasite Imunol. 1999; 21: 423-431.
38. Anthony R.M., Rutitzky LK.I., Urban J.F. et al. Protective
immune mechanisms in helminth infection. Nat. Rev. Immunol.
2007; 7; 975-987.
39. Maizels R., Hewitson J.P., Smith K. Susceptibility and
immunity to helminth parasites. Current Opinion in Immunol-
ogy. 2012; 24: 459-466.
Дана Спот-Он Капли от блох д/кошек более 3кг 1пипет. (1/2)
Дана Спот-Он Капли от блох д/кошек более 3кг 1пипет. (1/2) | От блох и клещей. Уход для кошекВы выключили JavaScript. Для правильной работы сайта необходимо включить его в настройках браузера.
0.0132401011 c
62 р.
Защита покупателя Нашли дешевле?
СП
6 Быстрая покупка со сроком доставки до 6 дней. В таких покупках не нужно ждать, когда подтвердят заказ. Вы оформляете заказ и сразу оплачиваете его.
Капли Дана Спот-Он назначают кошкам весом более 3 кг для лечения и профилактики энтомозов, вызываемых блохами, вшами и власоедами, акарозов, вызываемых саркоптоидными, иксодовыми и демодекозными клещами, пушным зверям – для лечения и профилактики отодектоза. Можно применять с 12-недельного возраста. Способ применения: Применяют однократно путем капельного нанесения на сухую неповрежденную кожу в места недоступные для слизывания животным (область спины между лопатками или область шеи у основания черепа).
Универсальный питательный корм для водяных черепах, а также лягушек, тритонов, ящериц и крупных акв… Таблетки Азинокс Плюс применяют для лечения и профилактики нематодозов (токсокарозов, токсаскаридоз… Биоспрей GreenFort Neo — это безопасное средство для бережной защиты кошек, кроликов и собак от экт… Биоошейник Favorite для кошек предназначен для профилактики и борьбы с блохами, клещами, вшами, вла… Репелентные капли Mr.Kiss на натуральной основе — это эффективная и бережная защита кошек от нападе… Капли БлохНэт Max для кошек применяют при энтомозах, отодектозе, поражении иксодовыми клещами и вла… Капли Дана Спот-Он назначают кошкам весом до 3 кг для лечения и профилактики энтомозов, вызываемых… Эмульсим Дельцид — это инсектоакарицидное лекарственное средство для наружного применения, предназн… Ошейник Чистотел Плюс для кошек применяют для уничтожения блох, вшей, власоедов и иксодовых клещей…Смотрите также
СкаÑаÑÑ ÐаÑеÑÐ¸Ð°Ð»Ñ Ð¾Ð´Ð½Ð¸Ð¼ Ñайлом (PDF)
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Раздел II Здоровье и
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Спортивная медицин
Почему современная наука основана на вере? / Комментарии / Хабр
Вы четко высказались, что локдаун — слишком суровая мера, экономика схлопнулась.
А можете продолжить моё высказывание, а то вы (не) цитируете не до конца?
Я сказал, если что, что локдауны — слишком суровая мера, экономика схлопнулась, прогнозируется под лям смертей при 600к смертях от ковида даже с лайтовыми локдаунами (про то, что миллион больше 600к, я не писал, но специально для вас могу это уточнить отдельно). Как вы из этого делаете вывод, что мне пофиг на смерти?
Т.е. чем-то недовольны.
Чем?
Прекратите, пожалуйста, додумывать и спорить с ветряными мельницами.
При этом есть данные об эффективности локдаунов
У меня другие данные. Об эффективности масок — да. Об эффективности локдаунов — хрен его знает, недостаточно данных, и консенсуса нет (что в текущих условиях по факту означает, что могли бы и несильно напрягаться).
Прививки есть, темпы вакцинации — крохотные.
Антиваксеров, плоскоземельщиков и прочей ерунды и в США полно, однако куча людей уже привита. Почему? Потому что в этом нашем США доверие людей к власти чуть больше, чем в РФ. Не диссиденты мешают, а потерявшая кредит доверия власть.
Нет, не всегда. До 19 года глобальной пандемии тяжелой инфекции не было.
До 19-го года ежегодно люди в РФ гибнут десятками тысяч от гриппа. Все, умершие от ковида за прошлый год, наберутся за 3-6 лет обычного гриппа. Война есть постоянно. Война вечна. Океания всегда воевала.
Это тоже ваши фантазии. Пристрелите парочку полицейских, у вас за это гарантированная смертная казнь.
Сейчас мне расскажут про правоприменительную практику в США.
Меня не то в тюрьму не посадить могут, меня могут вообще отпустить, если я, например, убью полицейского во время no-knock-обыска, пользуясь castle doctrine, и копы не смогут доказать, что они сделали всё возможное, чтобы я понял, что это действительно полиция, а не воры.
А поднять на революцию в едином порыве — ну-ну.
Удивлён такое от вас слышать, ну да ладно.
И, кстати, у вас тоже регулярно кто-то кого-то расстреливает. Видимо есть и обратная сторона медали от владения оружием.
…ага, в местах, где оружие по тем или иным причинам запрещено, от здания федекса до барного района (техасское правило 51%, вот это всё).
Ну вы при этом спокойно игнорируете научные данные
Какие научные данные я проигнорировал? Конкретно, если можно.
имеете свое, отличное, от ученых мнение
Шибко умный, заткнуть рты. Я помню, да.
Но я вас понимаю: своя рубашка ближе к телу. Вы вышли из зоны комфорта, потеряв из-за локдауна работу.
Я её потерял ещё до локдауна, просто на фоне падения экономики. Из-за локдауна закрылась компания, куда я нацеливался идти после, но неважно.
Понятно, что вы будете всеми силами топить против локдаунов, независимо от их эффективности и реальной угрозы ковида.
Нет, не понятно. Ещё раз, зачем? Это нерациональное поведение. Я, блин, недвигу купил из-за падения экономики кэшем без ипотеки, что год назад я себе позволить не мог, и сижу дома и занимаюсь чем-то, довольно близким к тому, чем занимался бы на работе. Из-за каких эмоций, ещё раз, мне топить против локдауна?
Ну если ученые пришли к выводу, что локдаун оправдан — это вполне себе повод посидеть в изоляции.
Рецензированные научные статьи с оправданностью локдауна в студию, если можно.
То, что сейчас локдаун не нужен — понятно исходя из наличия вакцин
Наличия вакцин недостаточно. Нужно, чтобы определённая доля людей вакцинировалась, а до этого ещё нескоро.
перестроенной системы здравоохранения.
Успели подготовить сотни тыщ медсестёр и врачей за год?
Итак, для вас ковид по тяжести сопоставим с гриппом?
~50к смертей в тяжёлый год от гриппа, 300-500к смертей за всю пандемию от ковида — очень схоже. Прям как ВОВ (с 12 миллионами) и ковид (с 0.15-0.3 миллионами). Не понимаю, что вас смущает. И вообще, это гипербола.
Ваша риторика тоже прекрасна.
Без перевода стрелок можете что-нибудь сказать про ваш социал-дарвинизм с руками, ногами и головой?
По фиг на всех, потому что всем по фиг на меня.
Эм, ну да. Просоциальное поведение опирается на то, что я получу поддержку от социума
- в ответ на это самое просоциальное поведение, и
- когда она мне нужна.
Если я её не получаю, если социум говорит «пофиг на тебя вообще», то назовите мне, пожалуйста, хоть одну причину учитывать чьи-то интересы, кроме своих собственных.
И? Есть пожар. Его надо тушить или нет? Пожар есть — ковид пандемия.
И вы тушите натрий с калием водой.
Но когда полгода встать не можешь, потому что пцр-отрицательный, а температура держится и слабость.
Или когда вроде оклемался, а потом внезапно кряк и нету человека.
Вы забыли собственные мантры?
В первом случае — эфемерная фикция-демагогия.
Во втором — такова жизнь. Тяжёлые времена. С ВОВ вообще один из ста мужчин вернулся.
Не очень умные люди, которые сами не захотели самоизолироваться — в конце концов повыпиливаются. Ну туда им и дорога? У них был свободный выбор?
Тогда всех вообще надо посажать по одиночным камерам и всё, иначе не очень умные люди найдут способ выпилиться.
Впрочем, с патерналистом я никогда не найду общий язык, это просто какие-то фундаментально разные жизненные ценности.
В чем противоречие? Я не вижу.
Зачем лишать хорошего выбора?
Да и как выбор может быть хорошим, если не очень умные люди повыпиливаются? Вы что, опять социал-дарвинист?
Оценивали, может пациент пользу государству принести или нет. Если в пациента нужно вложить больше денег, чем он заработает за всю жизнь, то это точно эвтаназия. Общество не должно оплачивать эгоистичное желание жить одного конкретного инвалида.
Ваш подход, поразительно похож на этот. Только от него после 45 года, почему-то отказались.
Во-первых, это не мой подход, потому что, при всей ужасности личных трагедий, тут приходится оперировать статистикой, а не рассматривать каждого конкретного человека. А статистика — штука бездушная, и именно ей государства и оперируют, когда решают, сажаться ли на локдаун, насколько, когда с него слезать, и так далее.
Во-вторых, попробуйте заболеть чем-нибудь, от чего нет лечения в вашей стране, и будете неприятно удивлены, насколько государство будет стремиться вас обеспечить возможностью развить до нужного вам уровня экспериментальное лечение или хотя бы отправить вас в другую страну. Просто, ну, государство экономическую эффективность этого уже посчитало.
Пусть сами карабкаются?
Как же я с вас ору.
Если у инвалида есть руки, ноги и голова (да, такие тоже бывают, инвалиды — не только люди без некоторых конечностей), то он сам как-нибудь разберётся. Не вы ли это писали?
И вообще, в ВОВ (да и после ВОВ) с ними не особо церемонились.
Ну или ваша любимая аналогия: На вашу страну — напали.
Моя любимая?
Вы будете просчитывать что дешевле — давать отпор врагу или забить? А то вдруг, сопротивляться дороже выйдет? Экономика пострадает…
Да, буду. Просто почти всегда оказывается дешевле попробовать дать отпор (но не всегда, такие случаи в истории известны).
Напомню, что у вас регулярно отбирают некоторый процент вашего дохода, и вы, очевидно, считаете, что дешевле смириться, чем давать отпор.
Понятно ведь, что в локдаун не вообще всех загнали по домам, а всех, кого можно загнать.
Чем другие люди хуже? Пофиг на них, да?
В том, что есть исследования и есть консенсус в среде ученых, какие меры эффективны, а какие нет.
И на тему локдаунов консенсуса нет.
Вы пытаетесь применить «научный подход», для обоснования заранее известного результата (локдаун вам не выгоден).
Он мне более чем выгоден. Авось ещё чего куплю.
Для вас грипп и ковид — это где-то рядом
А что, нет? Там этак 300 тыщ смертей, тут — 50 в год. Очень рядом, на мой взгляд. Куда ближе друг к другу, чем к ВОВ.
Если ВОВ и ковид для вас рядом, то для любой разумной метрики это — ещё более рядом.
а вакцины — экспериментальное лечение. Видимо, не рекомендумое. Экспериментальное же.
Опять что-то додумали и боретесь с ветряными мельницами. Вложили какую-то эмоциональную нагрузку в мои слова, и потом обижаетесь.
Чисто фактологически, являются ли вакцины от ковида экспериментальными?
При этом у вас есть готовое решение: забить болт и пустить все на самотек. Ну как бы вот она вся ущербность.
Практика (Флориды и Техаса, например) показывает, что это офигенное решение. А другая практика (Калифорнии и Нью-Йорка) показывает, что обратное решение — ну так, не оч.
Показалось негативное отношение.
Когда кажется — надо креститься. А ещё неплохо бы пройтись по комментарию, который вы не успели отправить, и поправить предыдущее написанное.
Ну, как вы посчитаете потерянные годы жизни — это большой вопрос и демагогия.
Продолжаю орать.
То у вас отсылки к учёным и авторитету, то те статьи, что вам не нравятся — а и пофиг, что они написаны учёными, вам виднее, что это вопрос и демагогия.
Противоречий вы, я уверен, не увидите.
но вы сами в ответе за свою жизнь
Опять социал-дарвинизм. Я в ответе за свою жизнь так же, как упомянутые вами выше инвалиды. Вы должны перераспределить в мой адрес своё человеческое тепло и любовь к ближнему.
Психиатры они созданы именно для решения таких проблем.
У меня тогда пукалки отберут 🙁
А тут, кто-то посторонний накашлял и приплыли.
Не понял, к вам домой кто-то пришёл и накашлял? А зачем вы его впустили?
Вы не видите разницы между ковидом и гриппом.
Прямую цитату, где я говорю, что не вижу разницы между ковидом и гриппом.
Другие лежат овощами.
Тяжёлые времена, не забывайте.
Вы не самоизолируетесь и помогаете разносить заразу дальше.
Я на самоизоляции уже полтора года (ну, просто я и так так живу, когда на работу ходить не нужно). Кстати, это ещё раз говорит о том, почему вы мне должны перераспределить что-нибудь, так как я демонстирую очень просоциальное поведение.
надо было дома сидеть?
Эм, ну вообще-то да. Вы разве не за это агитируете?
И судя по тому, что в штатах тоже вводили локдаун, в штатах тоже понимают, что демократия работает не везде и не всегда.
Штаты большие. Есть штаты (именно с маленькой буквы), где вводили разного рода ограничения, есть — где не вводили, есть — где вводили на пару недель, в самом начале, когда информации было мало.
Читаю. И есть подозрение, что вы лукавите.
Удобно. Всё, что не вписывается в вашу картину мира из претендующего на объективность — фикция, эфемерность, демагогия. Субъективный опыт, не вписывающийся в вашу картину мира — лукавство.
По-моему, вы для себя всё решили.
Ну так скорее всего, локдаун продолжаться не будет. Прививки подъехали.
И сразу все привились, ага. Ещё раз, сколько там привитых в РФ?
Так что есть подозрение, что в вас говорит обида за полученный ущерб.
Обида у меня, конечно, есть, но, к счастью, кроме обиды локдаун (ну, его жалкая пародия здесь, вернее) принёс мне много хорошего (например, помимо недвиги, это отличная отмазка от того, чтобы не летать в другие места к людям, которых я не очень хочу видеть, или вот кое-какие ещё вещи стали халявнее и доступнее — да мне одни профиты от локдауна, ё-моё). Если бы я руководствовался только эмоциями, я бы хотел, чтобы он продолжался вечно.
Так и смотрите корректно: риск побочек от прививки ниже приемлемого порога. Риск словить осложнения и тяжелое течение от ковида — кратно выше. Вакцинация — обмен высокой вероятности, на низкую.
Я понимаю, что умножение — это сложная операция.
Т.е., что такое гипербола вам не понятно.
Эта ваша фраза гипербола? Ну, «Сейчас похожая ситуация.» Если это гипербола, то что тогда не гипербола?
Я не знаю как вам по другому донести, что вирус — опасен.
Все вирусы опасны. Мой школьный приятель умер после осложнений от гриппа, например. Если у вас никто не умер от гриппа, то, не знаю, что вы там обычно говорите про мнение таких людей?
Смотрим на статистику избыточной смертности и видим, что она есть. Если это не повод реагировать, то я не знаю, что есть повод.
Существование избыточной статистики повод? Супер. Она и от гриппа есть. И от туребкулёза. И от автомобилей. Тушите все эти пожары, как закончите тушить — поговорим.
И да, в войну автомобили вполне конфисковывают, так что отобрать у всех автомобили будет разумно.
От вас, кстати, ждут ссылки на исследования, которые рубли/доллары в годы жизни переводят.
А помидоры в годы жизни вам переводить не нужно?
Я дал прямую ссылку на оценки снижения ожидаемой продолжительности жизни. Какие ещё ссылки и зачем вам давать?
Таки есть серьезные подозрения, что смерти из-за экономики — это что-то умозрительное, а смерти от болезней — вполне себе реальные и осязаемые.
Как и ожидалось. Не вписывается в вашу картину мира — что-то умозрительное.
У меня, если что, насчёт разных вирусов год назад тоже было немного другое мнение — но я его откорректировал, проработал ошибку, понял, откуда она возникла на метауровне, и сделал выводы (и метавыводы, хехе).
Трипарсамид — обзор | ScienceDirect Topics
2.3 Активность против африканского трипаносомоза
Было обнаружено, что ряд органо-мышьяковистых веществ очень эффективен при лечении поздних стадий заболевания с поражением центральной нервной системы. Препараты, которые успешно применялись против африканского трипаносомоза (африканской сонной болезни), вызываемого Trypanosoma brucei gambiense и T. brucei rhodesiense, , — это трипарсамид ( 7 ), меларсопрол (Mel B, 8a ), меларсонил. калий (Mel W, 8b ) и меларсен натрия ( 9 ) [2,4–6,8–10,35,36].
(а) Трипарсамид (7): это препарат второй линии для лечения африканского трипаносомоза у человека. Для лечения позднего заболевания из-за T.b. gambiense трипарсамид вводится внутривенно в дозе 2–3 г / взрослым в неделю в 10–12 дозах. Однако для лечения запущенных случаев T.b. rhodesiensis с поражением ЦНС, трипарсамид назначают в сочетании с сурамином [9]. Другая схема дозирования включает одну инъекцию (внутривенно) 30 мг / кг трипарсамида каждые 5 дней в течение 12 инъекций.При необходимости курс лечения можно повторить через месяц [12].
Частые побочные эффекты препарата — тошнота и рвота. Однако препарат также может вызывать случайную атрофию зрительного нерва, слепоту, потерю аппетита, диарею, повреждение почек, эксфолиативный дерматит, аллергические реакции и даже смерть [9,12].
(b) Меларсопрол ( Mel B , 8a ): это препарат выбора для лечения стадии менингоэнцефалита гамбийского и родезийского трипаносомоза.Рекомендуемая доза Mel B для взрослых составляет 2-3,6 мг / кг внутривенно ежедневно в течение 3 дней. Через неделю препарат вводят в дозе 3,6 мг / кг (в / в) ежедневно в течение 3 дней. Этот график доз повторяется снова после перерыва в 10-21 день [12]. Детям начальная доза 0,36 мг / кг вводится внутривенно, а затем доза постепенно увеличивается до максимальной 3,6 мг / кг с интервалом 1-5 дней, всего 910 инъекций. Общая доза препарата у детей в месяц не должна превышать 18-25 мг / кг [12].
Mel B менее токсичен, чем трипарсамид. Однако его использование может быть связано с поражением почек и миокарда, альбуминурией, гипертонией и коликами. Другие побочные эффекты препарата — желтуха, диарея и инфекции конъюнктивы [9,12]. Примерно у 1% пролеченных пациентов может развиться энцефалопатия [37]. Также известно, что препарат вызывает головную боль, тремор, лихорадку, судороги, кому и смерть. Противопоказан во время эпидемий гриппа и дефицита G-6-PD [36,38].
(c) Меларсонил калий ( Mel W , 8b ): он более токсичен и менее активен, чем Mel B.Единственное преимущество этого препарата состоит в том, что, в отличие от Mel B, его можно вводить внутримышечно или подкожно. Таким образом, это может быть полезно при лечении детей, которым невозможно внутривенное введение [39,40]. Препарат можно назначать в дозе 3-4 мг / кг (максимум 200 мг) ежедневно в течение 3-4 дней. При необходимости терапию можно повторить через 2 недели [41].
Меларсен натрия ( 9 ): Его вводят внутривенно в дозе 20 мг / кг, вводя 8–12 доз с интервалом в 5–7 дней.Профиль токсичности препарата очень похож на профиль трипарсамида [41].
Эффективность трех утвержденных препаратов in vitro и их синергетическое взаимодействие против Leishmania infantum
Лейшманиоз — одна из забытых тропических болезней. От него страдают до 12 миллионов человек, живущих в эндемичных районах 98 стран. Около 350 миллионов человек считаются подверженными риску, большинство из них — в развивающихся странах 1 — 3 . Виды Leishmania вызывают широкий клинический спектр, который включает кожный, слизисто-кожный и висцеральный лейшманиоз.Наиболее распространенной является кожная форма, которая вызывает уродливые и стигматизирующие поражения кожи, тогда как кожно-слизистый лейшманиоз встречается значительно реже. Висцеральный лейшманиоз без лечения фатален 4 .
В настоящее время для лечения лейшманиоза используется ограниченный выбор лекарств. Нет одобренных вакцин или профилактических препаратов. Пятивалентные соединения сурьмы, стибоглюконат натрия, пентамидин, различные препараты амфотерицина B, милтефозин и паромомицин являются одобренными лекарствами в настоящее время.Имиквимод и ситамахин проходят клиническую оценку 5 . Однако доступные лекарственные средства имеют ограничения, которые включают токсичность, длительные курсы, высокую стоимость, нежелательный путь введения, тератогенность и лекарственную устойчивость.
На данный момент на рынке нет безопасного и эффективного препарата против лейшмании. 6 . Недавние исследования, финансируемые различными организациями, направлены только на клинические испытания и диагностические исследования лейшманиоза в эндемичных странах.Следовательно, все еще существует острая необходимость в разработке новых лекарств от лейшманиоза.
Испытания новых лекарств в настоящее время нацелены на вмешательство в жизненно важные биохимические и метаболические пути паразита, и в этом смысле ферменты являются наиболее важным объектом внимания. Целевые ферменты у паразита должны иметь серьезные структурные и функциональные отличия от таковых у млекопитающего-хозяина для достижения селективного ингибирования целевых сайтов 7 .
Перепрофилирование существующих лекарств оказалось успешным для лечения забытых тропических болезней.Новые виды применения, одобренные Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), представляют собой сокращение между доклиническими испытаниями и клиническими испытаниями. Эта стратегия сокращает средства, необходимые для доклинических исследований и изучения профилей безопасности и фармакологических характеристик 8 , 9 .
Для этого исследования мы выбрали три препарата, одобренных FDA, а именно ауранофин, лопинавир / ритонавир и сорафениб, которые действуют как ингибиторы различных ферментов протеазы, чтобы изучить их влияние в качестве монотерапии и комбинированной терапии на Leishmania infantum.Leishmania spp. протеазы являются очень важными факторами вирулентности, поскольку они участвуют в инвазии тканей хозяина, выживании внутри макрофагов и модуляции иммунного ответа хозяина, для чего они считаются хорошими мишенями 10 . Эффективность препаратов сравнивали с эффективностью амфотерицина B, полиенового антибиотика, который действует на стерины мембран Leishmania spp. промастиготы, вызывающие потерю барьера проницаемости для малых метаболитов 11 . Хотя амфотерицин B широко используется для лечения лейшманиоза, его токсичность значительна 12 .
Ауранофин — золотосодержащий препарат, применяемый при лечении ревматоидного артрита. Он появился как сильный ингибитор тиоредоксинредуктаз млекопитающих 13 . Недавно препарат продемонстрировал замечательную противопаразитарную активность, ингибируя ферменты, участвующие в контроле процесса восстановления / окисления (окислительно-восстановительного процесса). Эти ферменты необходимы для поддержания внутриклеточных уровней активных форм кислорода. Leishmania и другие трипаносоматиды содержат трипанотионредуктазу, ключевой фермент окислительно-восстановительного метаболизма 14 .
Трипанотионредуктаза и глутатионредуктаза млекопитающих демонстрируют заметные различия в структуре, подтверждающие, что специфические ингибиторы, разработанные против трипанотионредуктазы, являются идеальным лекарством против Leishmania spp. без изменения активности глутатионредуктазы млекопитающих 7 .
Лопинавир / ритонавир — высокоактивный антиретровирусный препарат, используемый против ВИЧ 15 . Препарат представляет собой ингибитор аспартилпептидазы, состоящий из двух антиретровирусных препаратов: лопинавира и ритонавира в соотношении 4: 1 16 .Пептидазы играют важную роль в широком спектре биологических функций 17 . Они признаны терапевтическими мишенями для лечения серьезных заболеваний и многих микроорганизмов, включая Leishmania 18 — 20 . Эти ферменты подразделяются на пять различных кланов (AA, AC, AD, AE и AF) и 16 семейств в соответствии с базой данных MEROPS. Классические аспарагиновые пептидазы Клан AA далее подразделяется на восемь семейств, из которых семейство A2 включает пептидазу ВИЧ.У Trypanosomidae аспарагиновые пептидазы принадлежат к двум кланам: клану AA и клану AD 21 .
Недавно совместная инфекция Leishmania spp. и ВИЧ все чаще регистрируется в эндемичных по лейшманиозу районах 4 . Введение высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) показало заметное снижение коинфекции Leishmania / ВИЧ в отношении заболеваемости, патологии и клинических проявлений болезни. 22 . Экспериментальные исследования различных видов Leishmania с использованием ингибиторов пептидазы ВИЧ подтвердили эпидемиологические результаты, подтверждающие снижение заболеваемости сочетанной инфекцией Leishmania / ВИЧ после лечения этими препаратами. 21 — 25 .
Сорафениб — это мультикиназный ингибитор, используемый для лечения запущенной гепатоцеллюлярной и почечно-клеточной карциномы. Недавно он был идентифицирован как активный агент против L. donovani и различных видов Leishmania, вызывающих кожный лейшманиоз 26 . Большое количество киназ, особенно циклин-зависимых и митоген-активируемых киназ, отвечает за контроль клеточного цикла у Leishmania. Хотя киназы признаны мишенями для многих заболеваний, они плохо изучены как мишени для Leishmania ( 27 ). Антилейшманиозная активность сорафениба обусловлена неспецифическим ингибированием многих различных протеинкиназ, а не киназ млекопитающих. 28 .
Комбинированная терапия — стратегическая альтернатива лечению инфекционных заболеваний. В настоящее время он считается одной из наиболее рациональных альтернатив для повышения активности лекарственного средства, сокращения продолжительности и дозировки лечения, снижения токсичности и отсрочки или предотвращения лекарственной устойчивости. Эффективно применяется при лечении малярии, туберкулеза и СПИДа. 29 .Однако лечить лейшманиоз комбинированными препаратами нечасто. 30 — 32 , но возникла необходимость в комбинированной терапии против лейшманиоза 33 .
В этом исследовании мы оценили антилейшманиозный эффект ауранофина, лопинавира / ритонавира и сорафениба против промастигот L. infantum по сравнению с золотым стандартом лекарственного средства от лейшманиоза, амфотерицином B. Также были изучены синергетические, аддитивные или антагонистические эффекты комбинированной терапии. , а также морфологические изменения паразита, подвергнутого лечению вышеуказанными препаратами на ультраструктурном уровне.
Материалы и методы
Поддержание штамма Leishmania
Leishmania infantum MON1 — штамм висцерального лейшманиоза, использованный в этом исследовании. Его любезно предоставил профессор Жан Дюпуи Каме, президент Европейской федерации паразитологов. В дальнейшем он находился в лаборатории отделения медицинской паразитологии медицинского факультета Александрийского университета. Промастиготы Leishmania infantum поддерживали в стандартных условиях культивирования в среде Novey-MacNeal-Nicoll (NNN).Субкультивирование паразитов проводили каждые семь дней 34 .
Протестированные препараты
В этом исследовании использовались три коммерчески доступных препарата, одобренных FDA: ауранофин, приобретенный у Abbott; лопинавир / ритонавир, закупленный в Astellas pharma SPA, и сорафениб, закупленный у Bayer. Амфотерицин B использовался как золотой стандарт.
Определение антилейшманиальной активности in vitro
Десять мкМ исходных растворов были приготовлены из каждого лекарства в 1% ДМСО.Отрицательный контроль готовили из 1% ДМСО, а положительный контроль представлял собой 10 мкМ AmB. Мы инкубировали 1 x 10 6 промастигот Leishmania, суспендированных в 100 мкл питательной среды, в течение трех часов перед добавлением исследуемых препаратов. После 48 часов инкубации с каждым лекарственным препаратом при 25 ° C аликвоту каждой пробирки добавляли к равному количеству раствора, содержащего 0,2% формалин, чтобы остановить движение паразитов и облегчить подсчет с использованием камеры Нойбауэра 35 . Ауранофин, лопинавир / ритонавир и сорафениб тестировались в возрастающих концентрациях от 0.От 1 до 20 мкМ. Амфотерицин B тестировали в диапазоне разведений от 0,01 до 17 мкМ.
Определение индекса фракционной ингибирующей концентрации, построение изоболограммы и классификация характера взаимодействия.
Фракционная ингибирующая концентрация (FIC) — это концентрация, которая вызвала 50% -ное снижение роста (EC 50 ) промастигот. Он был рассчитан для каждого тестируемого препарата и каждой концентрации. Все тесты были выполнены в трех экземплярах 9 .
Для проверки синергизма препараты оценивали в четырех повторностях индивидуально для определения ЕС 25 ; каждое соединение в паре должно было ингибировать 25 ± 10% роста в необработанной среде.
Комбинации лекарств, которые показали возможный синергизм, были подвергнуты формальному анализу изоболограмм с использованием метода фиксированного соотношения 36 .
Серийные двукратные разведения проводили в трех экземплярах. Мы рассчитали ЕС 50 для каждого соотношения лекарств. Относительные ингибирующие концентрации рассчитывали следующим образом:
EC 50 в комбинации / EC 50 отдельных препаратов
Сумма FIC рассчитывалась следующим образом: Σ FIC = FIC препарат A + FIC препарат B.Средняя сумма FIC (Σ FIC) была рассчитана как среднее значение SFIC из трех различных фиксированных соотношений. Взаимодействия считались синергическими для Σ FIC ≤ 0,5, аддитивными для Σ FIC от 0,5 до 4 и антагонистическими для Σ FIC> 4 9 .
Ультраструктурное исследование
Для исследования промастигот L. infantum после обработки ауранофином, лопинавиром / ритонавиром и сорафениб в течение 48 часов при 26 ° C по сравнению с положительным и отрицательным контролями.Образцы были обработаны для SEM и TEM 37 , 38 .
статистический анализ
Все данные о бремени паразитов были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Аномально распределенные данные были выражены с использованием медианы (min-max) и сравнены с использованием теста Краскала-Уоллиса. Значимость между группами определялась с помощью теста Манна-Уитни. Значение p <0,05 считалось статистически значимым 39 .
Результаты
Антилейшманиозная активность in vitro
Было ясно, что все отдельные препараты, ауранофин, лопинавир / ритонавир, сорафениб и амфотерицин B, ограничивали рост паразитов in vitro после 48 часов репликации паразитов, тогда как ДМСО не оказывал значительного эффекта.Лопинавир / ритонавир снижал рост паразитов при 1,7 мкМ. Что касается ауранофина, более низкая концентрация препарата, ограничивающая рост паразитов на 50% (ЕС 50 ), составляла 1,5 мкМ. сорафениб, в то время как AmB показал самые высокие концентрации EC 50 (2,5 мкМ и 2 мкМ, соответственно) (таблицы 1 и 2).
Таблица 1
Влияние различных препаратов на пролиферацию промастигот Leishmania infantum in vitro
Таблица 2
EC50 * различных препаратов
* EC 50 значения являются средними значениями трех анализов.
Тестирование синергии и анализ изоболограмм
EC 25 значений были измерены для каждого из препаратов во всех возможных комбинациях (таблица 3). Четыре комбинации были протестированы в формальных анализах изоболограмм для количественной оценки взаимодействий с помощью этого стандартного метода.
Таблица 3
EC 25 * различных лекарств в каждой комбинации
EC 25 Значения являются средними значениями трех анализов.
Фракционная ингибирующая концентрация
Сумма FIC для комбинации А (ауранофин + лопинавир / ритонавир) = 1.53 + 0,45 = 1,98 = добавка.
Сумма FIC для комбинации B (сорафениб + лопинавир / ритонавир) = 0,59 + 0,8 = 1,39 = аддитивная.
Сумма FIC для комбинации C (ауранофин + сорафениб) = 1,2 + 0,48 = 1,68 = добавка.
Сумма FIC для комбинации D (ауранофин + лопинавир / ритонавир + сорафениб) = 0,17 + 0,12 + 0,2 = 0,49 = синергизм.
Когда эти результаты были статистически проанализированы, лопинавир / ритонавир не показал значительных отличий от других препаратов ни при использовании по отдельности, ни в комбинации.Подавление роста в среде, обработанной ауранофином, было значительно выше, чем в среде, обработанной сорафенибом и амфотерицином B, но не было обнаружено статистически значимой разницы между ним и любой комбинацией. Несмотря на снижение роста паразитов, сорафениб был наименее эффективным лекарством по сравнению с ауранофином и комбинациями B, C и D.
Комбинации B, C и D показали значительное снижение роста промастигот по сравнению с амфотерицином B и комбинацией A (таблица 4).
Таблица 4
Активность различных препаратов и их комбинаций против промастигот in vitro
Аномально распределенные данные были выражены с использованием медианы (мин-макс) и сравнивались с использованием теста Краскела-Уоллиса. Значимость между группами была установлена с помощью теста Манна-Уитни. Статистически значимы разные надстрочные индексы.
Ультраструктурное исследование
Сканирующая электронная микроскопия после 48 часов культивирования паразитов, инокулированных в свежую среду без добавления лекарственного средства, показала нормальную морфологию (рис. 1a и b).Промастиготы из всех обработанных сред показали искажение формы паразита с потерей жгутиков и образованием пузырей. Промастиготы, обработанные ауранофином, демонстрировали серьезное искажение формы, в то время как некоторые имели округлую форму (рисунок 1c). Нарушения в клеточной мембране паразита были очевидны у промастигот, обработанных лопинавиром / ритонавиром (рис. 1d), в то время как ямкообразные структуры на поверхности клеток наблюдались у паразитов, обработанных сорафенибом (рис. 1e).
Рисунок 1
Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в промастиготах из различных исследуемых сред.a и b: нормальная форма паразита, инокулированного в свежую среду без добавления лекарства после 48 часов культивирования. c: Паразиты, обработанные ауранофином, демонстрируют искажение формы и потерю жгутиков, а некоторые имеют округлую форму (стрелка). d: Серьезное искажение формы и потеря жгутиков с отслоением мембраны в промастиготе, обработанном лопинавиром / ритонавиром. e: Промастигот, обработанный сорафенибом, показывает большую ямочку (стрелка) на поверхности тела, а также потерю жгутиков.
Нормальное содержание ультраструктуры было обнаружено с помощью просвечивающей электронной микроскопии после 48 часов культивирования паразитов, инокулированных в свежую среду без добавления лекарства (рис. 2а и b).Ацидокальциноз был очевиден у паразитов из всех обработанных сред, что свидетельствовало об апоптозе. Промастиготы, получавшие ауранофин, показали очевидный ацидокальциноз (рисунок 2c). Промастиготы, обработанные лопинавиром / ритонавиром, показали очень очевидный ацидокальциноз, дегенерированную ядерную мембрану и гранулы хроматина, предполагающие апоптоз. Также присутствовали вакуоли с разной плотностью и везикулы аутофагии с двойной мембраной (рисунок 2d). Также был отмечен апоптоз, вызванный сорафенибом, с уменьшением цитоплазмы (рисунок 2e).
Рисунок 2
Ультраструктурные изменения промастигот из разных сред. a и b: нормальный паразит, инокулированный в свежую среду без добавления лекарственного средства, через 48 часов культивирования. c: Промастиготы, обработанные ауранофином, демонстрируют явный ацидокальциноз (стрелки). d: Промастиготы, обработанные лопинавиром / ритонавиром, демонстрируют очевидный ацидокальциноз (толстая стрелка) и дегенерированную ядерную мембрану (тонкая стрелка) с конденсированными гранулами хроматина вблизи ядерной мембраны, что указывает на апоптоз. Также присутствовали вакуоли с разной плотностью и везикулы аутофагии с двойной мембраной.e: Промастиготы, обработанные сорафенибом, демонстрируют ацидокальциноз и сокращение цитоплазмы (стрелка).
Обсуждение
Несмотря на несколько испытаний, эффективных вакцин против Leishmania spp. в настоящее время химиотерапия остается основой борьбы с лейшманиозом. Применяемые в настоящее время препараты небезопасны, дороги и вызывают резистентность 40 , тогда как лечение ингибиторами протеазы уже опробовалось в нескольких исследованиях. Соответственно, в этом исследовании мы оценили эффект трех различных коммерчески доступных ингибиторов ферментов против L.младенец. Мы сравнили монотерапию и комбинированную терапию ауранофином, лопинавиром / ритонавиром и сорафенибом. Лекарства были выбраны из-за их хорошо известной истории безопасного клинического профиля и ингибирования основных ферментов 41 .
Наши результаты показали, что ауранофин обладал наиболее эффективной против лейшманиозной активностью. Это единственный препарат, который при индивидуальном применении приводил к значительному подавлению количества паразитов по сравнению с амфотерицином B. При концентрации 10 мкМ ауранофин значительно снижал количество паразитов по сравнению с сорафенибом, но результаты были незначительными по сравнению с результатами лечения лопинавиром / ритонавиром.Кроме того, с ауранофином процент роста и LC 50 паразита были самыми низкими по сравнению с лопинавиром / ритонавиром, сорафенибом и амфотерицином B. Эффект ауранофина против L. infantum обусловлен ингибированием фермента трипанотионредуктазы. , одна из главных целей при открытии лекарств от лейшманиоза, поскольку она защищает паразита от окислительного повреждения и токсичных тяжелых металлов и позволяет доставлять восстанавливающие эквиваленты для синтеза ДНК 14 , 42 .Было обнаружено, что лопинавир / ритонавир более эффективен, чем амфотерицин B. Протеолитическая активность ингибиторов протеазы ВИЧ была продемонстрирована в других исследованиях различных видов Leishmania 21 , 24 , 25 , 43 . Алвес и др. 44 , объяснили другой способ их действия через модуляцию врожденных защитных механизмов через различные клеточные пути.
Они также показали, что, хотя ингибиторы протеазы ВИЧ очень эффективны для борьбы с ВИЧ, они также могут влиять на течение лейшманиоза у лиц с коинфекцией ВИЧ и лейшмании.
В настоящем исследовании сорафениб показал наименьшую лейшманицидную активность среди исследуемых препаратов. По сравнению с амфотерицином B он не уменьшал значительно количество промастиготов и имел более высокую ЛК 50 . Препарат является ингибитором мультикиназ, и было обнаружено, что он активен против L. donovani в культуре путем идентификации циклин-зависимых и митоген-активируемых киназ в качестве мишеней для лечения лейшманиоза. 26 , 27 . Недавно было обнаружено, что сорафениб использует неапоптотическую форму гибели клеток (ферроптоз) на опухолевых клетках.Ферроптоз — это регулируемая форма гибели клеток, возникающая в результате железозависимого накопления перекиси липидов, как показано Yu, et al. 45 .
Комбинированная терапия с коммерчески доступными лекарствами направлена на снижение стоимости, токсичности и продолжительности лечения и представляет собой многообещающее альтернативное обоснование. 46 . Поэтому мы попробовали лекарственные комбинации из двух и трех соединений. Результаты показали, что взаимодействия между комбинацией двух соединений были аддитивными.Что еще более важно, комбинация трех соединений показала синергетический эффект. Хотя ни лопинавир / ритонавир, ни сорафениб, применяемые по отдельности, не приводили к значительному подавлению паразита в сочетании, подавление значимо (комбинация B). Бутчер объяснил этот неожиданный результат комбинацией двух препаратов с разными биомолекулярными мишенями 47 . Кроме того, комбинация ауранофина и лопинавира / ритонавира (комбинация A) привела к значительному снижению количества паразитов по сравнению с амфотерицином B, возможно, из-за сильного антилейшманиального эффекта ауранофина, добавленного к другому механизму действия, проявляемому лопинавиром / ритонавиром. в модулировании иммунной системы.Наши результаты подтверждаются Lewis et al. приводит к модели на животных, где комбинация ауранофина и антиретровирусного препарата была способна значительно снизить посттерапевтическую виремию. 48 .
Использование препаратов с синергическим или аддитивным действием в комбинированной терапии задерживает или предотвращает развитие резистентности и может сократить продолжительность лечения, что, в свою очередь, снижает нежелательные эффекты каждого препарата. 49 , 50 . Более того, эта альтернативная стратегия приводит к сокращению затрат и времени 41 .Поиск синергизма путем комбинирования одобренных препаратов может быстро перейти в доклиническую и клиническую фазы. 51 .
Пытаясь изучить действие каждого препарата на промастиготы, мы провели ультраструктурные исследования обработанных паразитов. СЭМ промастигот, получавших ауранофин, лопинавир / ритонавир и сорафениб в течение 48 часов, показала серьезное искажение формы и потерю жгутиков с неровностями на поверхности клеток. Некоторые промастиготы, обработанные ауранофином, имели округлый вид.Sharlow и др. Обнаружили такую же морфологию у промастигот L. amazonensis, обработанных ауранофином 52 . Ригобелло и др. 13 , и Илари и др. 14 , приписали это округлое набухание ингибированию трипанотионредуктазы и перехода мембранной проницаемости. Это морфологическое искажение не наблюдалось ни с одним из известных лейшманицидных препаратов 52 .
В нашем исследовании ПЭМ-изображения показали, что ауранофин, лопинавир / ритонавир и сорафениб оказывают антилейшманиозное действие на L.младенческие промастиготы, вызывая апоптоз. Были некоторые изменения в основных органеллах, включая ядро, митохондрии и клеточную мембрану, в дополнение к изменениям в цитоплазматическом содержимом. Также наблюдались неровности клеточной мембраны. Наиболее ярким изменением ультраструктуры было присутствие большого количества ацидокальцисом в цитоплазме, что является важным свидетельством апоптоза 53 . Только промастиготы, которые лечились лопинавиром / ритонавиром, показали аутофагию в дополнение к апоптозу.Повышенное количество везикул разной плотности в цитоплазме, разрыв ядерной оболочки и наличие плотных хроматических гранул — признаки аутофагии 24 , 54 . Две основные формы запрограммированной гибели клеток, апоптоз и аутофагия, также были подтверждены в исследовании ультраструктуры L. amazonensis, обработанного ингибиторами протеазы ВИЧ 24 .
В заключение следует отметить, что применение комбинаций лекарств более эффективно, чем применение отдельных лекарств.Комбинации лекарств двух соединений привели к аддитивным взаимодействиям. Кроме того, те из трех соединений показали синергетическую активность. Синергизм с этой комбинацией лекарств выявляет структурно-функциональный подход в борьбе с лейшманиозом. Электронно-микроскопическое исследование показало, что три препарата проявляли свое антилейшманиозное действие, вызывая апоптоз, а также аутофагию в случае лопинавира / ритонавира. Эффективность этой комбинации лекарств может быть объяснена схожими механизмами действия ее соединений.Однако необходимы дальнейшие экспериментальные исследования для установления соотношения лечебных комбинаций и параметров токсичности этих соединений, а также другие исследования для проверки эффективности лекарственного средства на амастиготах.
Список литературы
Комитет экспертов ВОЗ по борьбе с лейшманиозами и Всемирная организация здравоохранения. Борьба с лейшманиозами: Отчет о заседании Комитета экспертов ВОЗ по борьбе с лейшманиозами, Женева, 22-26 марта 2010 г. Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2010 г.
Alvar J, Vélez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. Лейшманиоз во всем мире и глобальные оценки его заболеваемости. PLoS One. 2012; 7: e35671. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035671
Абу-Эль-Нага IF. Демографические, социально-экономические и экологические изменения, влияющие на распространение забытых тропических болезней в Египте. Азиатский Pac J Trop Med. 2015; 8: 881-8. https://doi.org/10.1016/j.apjtm.2015.10.015
Zijlstra EE. PKDL и другие кожные поражения у ВИЧ-инфицированных пациентов с лейшманиозом: обзор клинических проявлений в отношении иммунных ответов.PLoS Negl Trop Dis. 2014; 20: 8: e3258. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003258
Грогл М., Хикман М., Эллис В., Хадсон Т., Лазо Дж. С., Шарлоу Э. Р. и др. Алгоритм открытия лекарств от кожного лейшманиоза. Am J Trop Med Hyg. 2013; 88: 216-21. https://doi.org/10.4269/ajtmh.11-0812
Амато В.С., Туон Ф.Ф., Бача Х.А., Нето В.А., Никодемо АС. Лейшманиоз слизистых оболочек. Текущий сценарий и перспективы лечения. Acta Trop. 2008; 105: 1-9. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2007.08.003
Сингх Н., Кумар М., Сингх РК.Лейшманиоз: текущий статус доступных лекарств и новые потенциальные мишени для лекарств. Азиатский Pac J Trop Med. 2012; 5: 485-97. https://doi.org/10.1016/S1995-7645(12)60084-4
Экинс С., Уильямс А.Дж.. Поиск старых беспорядочных связей для новых целей. Pharm Res. 2011; 28: 1785-91. https://doi.org/10.1007/s11095-011-0486-6
Planer JD, Hulverson MA, Arif JA, Ranade RM, Don R, Buckner FS. Тестирование синергии одобренных FDA лекарств выявляет сильнодействующие комбинации лекарств против Trypanosoma cruzi. PLoS Negl Trop Dis.2014; 8: e2977. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002977
Das P, Alam MN, Paik D, Karmakar K, De T, Chakraborti T. Ингибиторы протеазы в потенциальной разработке лекарств от лейшманиоза. Индийский J Biochem Biophys. 2013; 50: 363-76.
Саха А.К., Мукерджи Т., Бхадури А. Механизм действия амфотерицина B на промастиготы Leishmania donovani. Мол Биохим Паразитол. 1986; 19: 195-200. https://doi.org/10.1016/0166-6851(86)-0
Альвар Дж., Крофт С., Оллиаро П. Химиотерапия в лечении лейшманиоза и борьбе с ним.Adv Parasitol. 2006; 61: 223-74. https://doi.org/10.1016/S0065-308X(05)61006-8
Ригобелло М.П., Скутари Г., Босколо Р., Биндоли А. Индукция перехода митохондриальной проницаемости ауранофином, производным золота (I) -фосфина. Br J Pharmacol. 2002; 136: 1162-8. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0704823
Илари А., Байокко П., Мессори Л., Фиорилло А., Боффи А., Грамичия М. и др. Золотосодержащий препарат против паразитарного метаболизма полиаминов: рентгеновская структура трипанотионредуктазы из Leishmania infantum в комплексе с ауранофином показывает двойной механизм ингибирования ферментов.Аминокислоты. 2012; 42: 803-11. https://doi.org/10.1007/s00726-011-0997-9
Чандвани А., Шутер Дж. Лопинавир / ритонавир в лечении инфекции ВИЧ-1: обзор. Ther Clin Risk Manag. 2008; 4: 1023-33. https://doi.org/10.2147/TCRM.S3285
Цветкович RS, Гоа KL. Лопинавир / ритонавир: обзор его использования при лечении ВИЧ-инфекции. Наркотики. 2003; 63: 769-802. https://doi.org/10.2165/00003495-200363080-00004
Клемба М., Голдберг DE. Характеристика плазмепсина V, мембраносвязанного гомолога аспарагиновой протеазы в эндоплазматическом ретикулуме Plasmodium falciparum.Мол Биохим Паразитол. 2005; 143: 183-91. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2005.05.015
Деруин Ф, Сантильяна-Хаят М. Лекарственные средства противотоксоплазменной активности и взаимодействия с пириметамином и сульфадиазином in vitro. Антимикробные агенты Chemother. 2000; 44: 2575-7. https://doi.org/10.1128/AAC.44.9.2575-2577.2000
Парих С., Гут Дж, Иштван Е, Голдберг Д.Е., Хавлир Д.В., Розенталь П.Дж. Противомалярийная активность вируса иммунодефицита человека 1 типа. Антимикробные агенты Chemother. 2005; 49: 2983-5.https://doi.org/10.1128/AAC.49.7.2983-2985.2005
Savoia D, Allice T, Тово ПА. Антилейшманиозная активность ингибиторов протеазы ВИЧ. Int J Antimicrob Agents. 2005; 26: 92-4. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2005.04.003
Сантос Л.О., Виторио Б.С., Бранкинья М.Х., Педросо и Сильва С.М., Сантос А.Л., д’Авила-Леви С.М. Нелфинавир эффективен в подавлении размножения и активности аспарагиновой пептидазы видов Leishmania, включая штаммы, полученные от ВИЧ-инфицированных пациентов.J Antimicrob Chemother. 2013; 68: 348-53. https://doi.org/10.1093/jac/dks410
Pozio E. Высокоактивная антиретровирусная терапия и оппортунистические простейшие инфекции. Parassitologia. 2004; 46: 83-9.
Trudel N, Garg R, Messier N, Sundar S, Ouellette M, Tremblay MJ. Внутриклеточная выживаемость видов Leishmania, вызывающих висцеральный лейшманиоз, значительно снижается ингибиторами протеазы ВИЧ-1. J Infect Dis. 2008; 198: 1292-9. https://doi.org/10.1086/592280
Santos LO, Marinho FA, Altoé EF, Vitório BS, Alves CR, Britto C и др.Ингибиторы аспартилпептидазы ВИЧ препятствуют клеточной пролиферации, ультраструктуре и инфицированию макрофагами Leishmania amazonensis. PLoS One. 2009; 4: e4918. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004918
Демарчи И.Г., Сильвейра Т.Г., Феррейра ИК, Лонардони М.В. Влияние ингибиторов протеазы ВИЧ на лейшманию Нового Света. Parasitol Int. 2012; 61: 538-44. https://doi.org/10.1016/j.parint.2012.04.006
Сандерсон Л., Ярдли В., Крофт С.Л. Активность противораковых ингибиторов протеинкиназы в отношении Leishmania spp.J Antimicrob Chemother. 2014; 69: 1888-91. https://doi.org/10.1093/jac/dku069
Клегхорн Л.А., Вудленд А., Колли И.Т., Торри Л.С., Норкросс Н., Лукш Т. и др. Идентификация ингибиторов протеинкиназы CRK3, связанной с Leishmania cdc2. Chem Med Chem. 2011; 6: 2214-24. https://doi.org/10.1002/cmdc.201100344
Караман М.В., Херргард С., Трейбер Д.К., Галлант П., Аттеридж С.Е., Кэмпбелл Б.Т. и др. Количественный анализ селективности ингибитора киназ. Nat Biotechnol. 2008; 26: 127-32.https://doi.org/10.1038/nbt1358
Гольдберг DE, Силичиано РФ, Якобс ВР. Перехитрить эволюцию: борьба с лекарственно-устойчивым туберкулезом, малярией и ВИЧ. Клетка. 2012; 148: 1271-83. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.02.021
Менез С., Буйз М., Беснар М. Взаимодействие милтефозина и амфотерицина B: последствия их деятельности в отношении эпителиальных клеток кишечника и промастигот Leishmania donovani in vitro. Антимикробные агенты Chemother. 2006; 50: 3793-800. https://doi.org/10.1128 / AAC.00837-06
Сейферт К., Мандей Дж., Сайеда Т. Взаимодействие in vitro между ситамахином и амфотерицином B, стибоглюконатом натрия, милтефозином, паромомицином и пентамидином против Leishmania donovani. J Antimicrob Chemother. 2011; 66: 850-4. https://doi.org/10.1093/jac/dkq542
de Morais-Teixeira E, Gallupo MK, Rodrigues LF, Romanha AJ, Rabello A. Взаимодействие in vitro между сульфатом паромомицина и четырьмя препаратами с лейшманицидной активностью против трех видов Leishmania Нового Света.J Antimicrob Chemother. 2014; 69: 150-4. https://doi.org/10.1093/jac/dkt318
Барретт М.П., Крофт С.Л. Лечение трипаносомоза и лейшманиоза. Br Med Bull. 2012; 104: 175-96. https://doi.org/10.1093/bmb/lds031
McCartry-Burke C, Bates PA, Dwyer DM. Leishmania donovani: использование двух различных коммерчески доступных сред с определенным химическим составом для непрерывного культивирования промастигот in vitro. Exp Parasitol. 1991; 73: 385-7. https://doi.org/10.1016/0014-4894(91)-A
Garcia LS.Восстановление паразитов: методы культивирования, инокуляция животных и ксенодиагностика. В: Гарсия Л.С., редактор. Диагностическая медицинская паразитология. 5-е издание. Вашингтон, США: Американское общество микробиологии; 2007. с. 927-8.
Fivelman QL, Adagu IS, Warhurst DC. Модифицированный метод изоболограмм с фиксированным соотношением для изучения in vitro взаимодействий между атоваквоном и прогуанилом или дигидроартемизинином против устойчивых к лекарствам штаммов Plasmodium falciparum. Антимикробные агенты Chemother. 2004; 48: 4097-102. Https: // doi.org / 10.1128 / AAC.48.11.4097-4102.2004
Klainer AS, Betsch CJ. Сканирующая электронная микроскопия избранных микроорганизмов. J Infect Dis. 1970; 121: 339-43. https://doi.org/10.1093/infdis/121.3.339
Bozzola JJ. Обычные методы подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии культивируемых клеток. Методы Мол биол. 2007; 369: 1-18. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-294-6_1
Чан YH. Биостатистика 102: количественные данные — параметрические и непараметрические тесты.Сингапур Мед Дж. 2003; 44: 391-6.
Siqueira-Neto JL, Song OR, Oh H, Sohn JH, Yang G, Nam J, et al. Высокопроизводительный скрининг антилейшманиозных лекарств выявляет кандидатов на лекарства с новыми каркасами. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4: e675. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000675
Gazanion E, Vergnes B, Seveno M. Активность комбинаций никотинамида и антилейшманиальных препаратов in vitro. Parasitol Int. 2011; 60: 19-24. https://doi.org/10.1016/j.parint.2010.09.005
Crowther GJ, Shanmugam D, Carmona SJ, Doyle MA, Hertz-Fowler C, Berriman M, et al.Выявление привлекательных мишеней для лекарств у патогенов забытых болезней с использованием подхода in silico. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4: e804. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000804
Valdivieso E, Dagger F, Rascon A. Leishmania mexicana: Идентификация и характеристика активности аспартил протеиназы. Exp Parasitol. 2007; 116: 77-82. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2006.10.006
Alves ÉA, de Miranda MG, Borges TK, Magalhães KG, Muniz-Junqueira MI. Препараты против ВИЧ, лопинавир / ритонавир и атазанавир, модулируют врожденный иммунный ответ, запускаемый лейшманией в макрофагах: роль NF-κB и PPAR-γ.Int Immunopharmacol. 2015; 24: 314-24. https://doi.org/10.1016/j.intimp
Yu H, Guo P, Xie X, Wang Y, Chen G. Ферроптоз, новая форма гибели клеток, и ее связь с опухолевыми заболеваниями. J Cell Mol Med. 2017; 21: 648-57. https://doi.org/10.1111/jcmm.13008
Mesquita JT, Tempone AG, Reimão JQ. Комбинированная терапия нитазоксанидом и амфотерицином B, глюкантимом, милтефозином и ситамахином против внутриклеточных амастигот Leishmania infantum. Acta Trop. 2014; 130: 112-6.https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2013.11.003
Мясник EC. Может ли биология клеточных систем спасти открытие лекарств? Nat Rev Drug Discov. 2005; 4: 461-7. https://doi.org/10.1038/nrd1754
Льюис М.Г., Да Фонсека С., Чомонт Н., Паламара А.Т., Тардуньо М., Май А. и др. Золотой лекарственный препарат ауранофин ограничивает вирусный резервуар в модели обезьяньего СПИДа и индуцирует сдерживание вирусной нагрузки после приостановки АРТ. СПИД. 2011; 25: 1347-56. https://doi.org/10.1097/QAD.0b013e328347bd77
Croft SL, Sundar S, Fairlamb AH.Лекарственная устойчивость при лейшманиозе. Clin Microbiol Rev.2006; 19: 111-26. https://doi.org/10.1128/CMR.19.1.111-126.2006
Olliaro PL. Комбинации лекарств от висцерального лейшманиоза. Curr Opin Infect Dis. 2010; 23: 595-602. Https://doi.org/10.1097/QCO.0b013e32833fca9d
Borisy AA, Elliott PJ, Hurst NW, Lee MS, Lehar J, Price ER и др. Систематическое открытие многокомпонентных терапевтических средств. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 7977-82. https://doi.org/10.1073/pnas.1337088100
Sharlow ER, Leimgruber S, Murray S, Lira A, Sciotti RJ, Hickman M, et al.Ауранофин является агентом, моделирующим апоптоз, с антилейшманиальной активностью in vitro и in vivo. ACS Chem Biol. 2014; 21: 663-72. https://doi.org/10.1021/cb400800q
González-Polo RA, Boya P, Pauleau AL, Jalil A, Larochette N, Souquère S и др. Парадокс апоптоза / аутофагии: аутофагическая вакуолизация перед смертью от апоптоза. J Cell Sci. 2005; 118: 3091-102. https://doi.org/10.1242/jcs.02447
Эдингер А.Л., Томпсон CB. Смерть по умыслу: апоптоз, некроз и аутофагия. Curr Opin Cell Biol.2004; 16: 663-9. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2004.09.011
Банкноты
Образец цитирования: Abou-El-Naga IF, Mady RF, Fawzy Hussien Mogahed NM. Эффективность трех одобренных препаратов in vitro и их синергетическое взаимодействие против Leishmania infantum. Biomédica. 2020; 40 (Прил.1): 89-101. https://doi.org/10.7705/biomedica.4891Вклад авторов: Иман Фати Абу-Эль-Нага задумал и разработал эксперименты. Эксперименты проводили Раша Фадли Мэди и Нермин Могахед Фаузи Хуссен Могахед.Все авторы проанализировали данные и написали статью.
Финансирование: исследование не получало специального гранта от какого-либо финансирующего агентства.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Заметки автора
* Автор, ответственный за переписку: Иман Фати Абу-Эль-Нага, ул. Абдель Хамид Эль-Диб, 12, Тарват, Александрия, Египет Телефон: (+20) 12 2950 1834; факс: (+20) 3483 1498 [email protected]
Эффективность эфирного липида эдельфозина in vitro и in vivo против Leishmania spp.и устойчивые к SbV паразиты
Аннотация
Фон
Лейшманиозы представляют собой комплекс забытых тропических болезней, вызываемых более чем 20 видами паразитов Leishmania , терапевтический арсенал которых недостаточен и неудовлетворителен. Пятивалентные сурьмы (SbV) в настоящее время являются фармакологическими препаратами первой линии для лечения лейшманиоза во всем мире, но все чаще сообщается о резистентности к этим соединениям. Аналоги алкил-лизофоспоголипидов (ALP) составляют семейство соединений с антилейшманиальной активностью, и один из его членов, милтефозин, был одобрен в качестве первого перорального средства для лечения висцерального и кожного лейшманиоза.Однако его клиническое применение может быть затруднено из-за менее впечатляющей эффективности у пациентов, инфицированных примерно видами Leishmania , включая L. braziliensis и L. mexicana , а также склонностью к развитию лекарственной устойчивости in vitro .
Методология / основные выводы
Мы обнаружили, что ALP ранжируют эдельфозин> перифозин> милтефозин> эруцилфосфохолин по их антилейшманиозной активности и способности способствовать апоптозоподобной гибели паразитарных клеток в промастиготных и амастиготных формах отдельных Leishmania spp., согласно оценке с помощью анализов пролиферации и проточной цитометрии. Эффективные концентрации антилейшманиальной ЩФ зависели как от вида паразита, так и от стадии его развития. Эдельфозин накапливался и убивал внутриклеточных паразитов Leishmania внутри макрофагов. In vivo противолейшманиальная активность была продемонстрирована после перорального лечения эдельфозином мышей и хомяков, инфицированных L. major , L. panamensis или L. braziliensis , без каких-либо значительных побочных эффектов.Эдельфозин также убивал устойчивых к SbV паразитов Leishmania в анализах in vitro и in vivo и требовал более длительного времени инкубации, чем милтефозин, для создания лекарственной устойчивости.
Выводы / Значение
Наши данные показывают, что эдельфозин является наиболее мощной ЩФ в уничтожении различных Leishmania spp. , и он менее склонен к развитию лекарственной устойчивости, чем милтефозин. Эдельфозин эффективен в уничтожении Leishmania в культуре и внутри макрофагов, а также в моделях животных, инфицированных различными Leishmania spp. и устойчивые к SbV паразиты. Наши результаты показывают, что эдельфозин является многообещающим пероральным антилейшманиозным препаратом для клинической оценки.
Сведения об авторе
Лейшманиоз представляет собой серьезную международную проблему здравоохранения, вызывает высокие показатели заболеваемости и смертности и классифицируется Всемирной организацией здравоохранения как возникающее и неконтролируемое заболевание. Миграция населения из эндемичных в неэндемичные районы и туристическая деятельность в эндемичных регионах распространяют болезнь на новые районы.К сожалению, лечение лейшманиоза далеко не удовлетворительное, поскольку доступно лишь несколько лекарств, которые проявляют значительные побочные эффекты. Здесь мы демонстрируем in vitro и in vivo доказательств антилейшманиальной активности эфирного фосфолипида эдельфозина, который эффективен против большого числа Leishmania spp. вызывает кожный, слизисто-кожный и висцеральный лейшманиоз. Наши экспериментальные модели на мышах и хомяках продемонстрировали не только значительную антилейшманиозную активность перорального введения эдельфозина против различных Leishmania spp. Дикого типа., но также против паразитов, устойчивых к пятивалентной сурьме, которые составляют первую линию лечения во всем мире. Кроме того, эдельфозин проявлял более высокую антилейшманиозную активность и меньшую склонность к развитию лекарственной устойчивости, чем милтефозин, первый препарат против лейшманиоза, который можно вводить перорально. Эти данные вместе с нашими предыдущими результатами, демонстрирующими противовоспалительное действие и очень низкий профиль токсичности, позволяют предположить, что эдельфозин является многообещающим пероральным лекарством от лейшманиоза, что требует клинической оценки.
Образец цитирования: Varela-M RE, Villa-Pulgarin JA, Yepes E, Müller I, Modolell M, Muñoz DL, et al. (2012) In vitro и In vivo Эффективность эфирного липида эдельфозина против Leishmania spp. и устойчивые к SbV паразиты. PLoS Negl Trop Dis 6 (4): e1612. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612
Редактор: Джейн Рапер, Школа медицины Нью-Йоркского университета, Соединенные Штаты Америки
Поступила: 7 ноября 2011 г .; Принята к печати: 27 февраля 2012 г .; Опубликован: 10 апреля 2012 г.
Авторские права: © 2012 Varela-M et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была поддержана Испанским Министерством культуры и инноваций (SAF2008-02251; SAF2011-30518; RD06 / 0020/1037) от Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer, Instituto de Salud Carlos III, софинансирование Fondo Europeo de Desarrollo Regional of the European Union; и TRA2009-0275), Седьмая рамочная программа Европейского сообщества FP7-2007-2013 (грант HEALTH-F2-2011-256986), Junta de Castilla y León (CSI052A11-2; GR15-Experimental Программа по терапии и трансляционной онкологии) и грант совместного проекта Испании и Великобритании от Королевского общества CSIC (2004GB0032).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: FM является соучредителем Apointech и членом его научно-консультативного совета. REV, JAVP и EY — сотрудники Apointech. Остальные авторы не сообщают о потенциальных конфликтах интересов.
Введение
Влияние лейшманиоза на здоровье человека в течение многих лет сильно недооценивалось, и этот комплекс болезней был классифицирован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как одна из наиболее игнорируемых тропических болезней [1].В течение последнего десятилетия эндемичные районы расширялись, и было зарегистрировано резкое увеличение числа случаев лейшманиоза. ВОЗ классифицирует лейшманиоз как заболевание категории 1 («возникающее и неконтролируемое»), и существует острая необходимость в разработке новых терапевтических препаратов и подходов. В настоящее время около 350 миллионов человек в 98 странах мира находятся в группе риска, и примерно 12 миллионов человек инфицированы [1]. Несмотря на прогресс в диагностике и лечении, лейшманиоз остается серьезной проблемой общественного здравоохранения, особенно в тропических и субтропических развивающихся странах.Опубликованные данные указывают на предполагаемую заболеваемость в два миллиона новых случаев в год, с 1,5 миллионами случаев самовосстановления, но обезображивающего кожного лейшманиоза и 500 000 случаев опасного для жизни висцерального лейшманиоза [1], [2]. Приблизительно 60 000 человек умирают от висцерального лейшманиоза каждый год, что превышает показатель среди паразитарных болезней только малярией; потеря около 2,4 миллионов лет жизни с поправкой на инвалидность (DALY) во всем мире была рассчитана как общее бремя болезни лейшманиозом [1] — [3].Кроме того, в ряде отчетов подчеркивается возрастающее значение висцерального лейшманиоза как оппортунистической инфекции среди ВИЧ-положительных пациентов в регионах, где обе инфекции являются эндемическими [4].
Химиотерапия, доступная в настоящее время для лечения лейшманиоза, далека от удовлетворительной и представляет несколько проблем, включая токсичность, множество побочных эффектов, высокую стоимость и развитие лекарственной устойчивости [2], [5]. Два соединения пятивалентной сурьмы (SbV), стибоглюконат натрия (Pentostam) и антимониат меглумина (Glucantime), были впервые представлены в 1940-х годах и с тех пор используются в качестве химиотерапевтических агентов первой линии против всех форм лейшманиоза путем парентерального введения.Хотя SbV, вводимый внутримышечно или внутривенно, остается препаратом первой линии для лечения лейшманиоза во всем мире, его эффективность становится все ниже [6] и сильно зависит от видов Leishmania и отдельных эндемичных региональных вариаций, даже в пределах та же страна. В настоящее время сопротивление широко распространено в Индии, и было показано, что уровень устойчивости превышает 60% в некоторых частях штата Бихар на северо-востоке Индии [7], [8]. Кроме того, частота побочных эффектов, включая миалгию, артралгии, панкреатит, нефротоксичность, гепатотоксичность и кардиотоксичность [1], [2], [9], делает поиск новых лекарств, альтернативных SbV, актуальной проблемой, и ряд лекарств сейчас проходят клинические испытания [10].Внутривенное введение липосомального амфотерицина B (AmBisome) в настоящее время является наиболее эффективным лекарством против Leishmania [2], [11], но его относительно высокая стоимость делает его недоступным в некоторых бедных регионах мира, где это заболевание более распространено. [2]. Кроме того, необходимость в длительных периодах парентерального введения, часто требующих госпитализации, также ограничивает клиническое использование амфотерицина B.
Милтефозин (Импавидо) — новое пероральное средство, показавшее высокие показатели излечения от висцерального лейшманиоза в Индии ( л.donovani ; 94% излечения) [12], а также при кожном лейшманиозе в Колумбии ( L. panamensis ;> 90% излечение) [13]. Однако недавнее терапевтическое исследование выявило ограниченный потенциал милтефозина в лечении американского кожного лейшманиоза с неудовлетворительным уровнем излечения в 69,8% в Колумбии [14]. Кроме того, этот процент снизился до 49%, когда милтефозин вводили пациентам с поражениями, вызванными L. braziliensis , которые составляют более 60% кожного лейшманиоза в Колумбии [14].Дополнительные недавние клинические испытания в Бразилии показали излечиваемость милтефозина для лечения кожного лейшманиоза, вызванного L. braziliensis , у 75% [15] и для лечения кожного лейшманиоза, вызванного L. guyanensis , у 71% [ 16]. Лечение милтефозином также привело к примерно 70% излечению лейшманиоза слизистых оболочек, вызванного L. braziliensis в Боливии [17], [18]. Кроме того, эффективность лечения кожного лейшманиоза милтефозином составила примерно 53% (33% для л.braziliensis и 60% для инфекции L. mexicana ) в Гватемале [13], [19], [20], а уровень излечения для L. tropica в Афганистане составил 63% [20]. Эти цифры контрастируют с показателями излечения более 82% при лечении висцерального лейшманиоза (кала-азар) в Индии [21], [22] и Бангладеш [23]. Эти данные указывают на большую вариативность результатов в зависимости от географического региона по причинам, которые не совсем понятны. Кроме того, милтефозин обычно вызывает побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта, такие как анорексия, тошнота, рвота и диарея, которые иногда приводят к отказу от лечения [1], [2], [22].Милтефозин является потенциально тератогенным и не должен назначаться беременным женщинам [1], [2], которым следует гарантировать адекватную контрацепцию во время лечения и до 3 месяцев после него [1], учитывая тератогенный потенциал милтефозина на животных моделях [ 24]. Дополнительную озабоченность вызывает быстрое формирование устойчивости in vitro к милтефозину [25] — [27], что может ограничить его клиническое применение. Таким образом, эти исследования подтверждают необходимость поиска новых терапевтических альтернатив в лечении лейшманиоза.
Эдельфозин (1- O -октадецил-2- O -метил- rac -глицеро-3-фосфохолин, ET-18-OCH 3 ) является многообещающим противоопухолевым эфирным липидным лекарственным средством [28] — [28] — [ 30], который не является мутагенным и действует путем активации апоптоза за счет взаимодействия с клеточными мембранами [31] — [34]. Помимо противоопухолевой активности, эдельфозин проявляет in vitro противопаразитарную активность против различных видов паразитов Leishmania [35] — [37].Эдельфозин считается прототипом молекулы довольно разнородного семейства синтетических соединений, известных как аналоги алкил-лизофосфолипидов (ALP), которые включают вышеупомянутый клинически значимый милтефозин, а также перифозин, который также проявляет активность против Leishmania [38] , [39]. Хотя механизм действия милтефозина против паразитов Leishmania еще предстоит полностью выяснить, есть некоторые сообщения, показывающие, что способность этого соединения способствовать апоптозной гибели клеток имеет решающее значение для его лейшманицидной активности [40], [41] .Поскольку было показано, что эдельфозин обладает более высокой проапотической активностью, чем милтефозин и перифозин, в отношении раковых клеток человека [29], [30], [33], мы провели здесь комплексное исследование in vitro и in vivo , исследование предполагаемых анти- Leishmania признаков эдельфозина по сравнению с другими ALP с использованием различных видов Leishmania , а также экспериментальных моделей мышей и хомяков.
Материалы и методы
Заявление о соблюдении этических норм
Процедуры на животных в этом исследовании соответствовали руководящим принципам Испании (Real Decreto RD1201 / 05) и Европейского Союза (Европейская директива 2010/63 / EU) по экспериментам на животных для защиты и гуманного использования лабораторных животных и проводились в аккредитованных Центр экспериментов на животных (Servicio de Experimentación Animal) Университета Саламанки (регистрационный номер: PAE / SA / 001).Процедуры были одобрены этическим комитетом Университета Саламанки (номер утверждения протокола 48531).
Наркотики
Эдельфозин (1- O -октадецил-2- O -метил- rac -глицеро-3-фосфохолин) был получен от INKEYSA (Барселона, Испания) и Apointech (Саламанка, Испания). Милтефозин (гексадецилфосфохолин) был от Calbiochem (Кембридж, Массачусетс). Перифозин (октадецил- (1,1-диметилпиперидинио-4-ил) фосфат) и эруцилфосфохолин ((13Z) -докос-13-ен-1-ил 2- (триметиламмонио) этилфосфат) были от Zentaris (Франкфурт, Франция). Германия).Исходные стерильные растворы отдельных ALP (2 мМ) были приготовлены в культуральной среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 10% (об. / Об.) Инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L- глутамин, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), как описано ранее [28].
Клетки Leishmania и условия культивированияВ данном исследовании использовались следующие штаммов Leishmania : L. amazonensis (MHOM / Br / 73 / LV78), L.braziliensis (MHOM / CO / 88 / UA301), L. donovani (MHOM / IN / 80 / DD8), L. infantum (MCAN / ES / 96 / BCN150), L. major LV39 (MRHO / SU / 59 / P), L. mexicana (MHOM / MX / 95 / NAN1) и L. panamensis (MHOM / CO / 87 / UA140).
Промастиготы Leishmania выращивали в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 26 ° C. Промастиготы лечили указанными соединениями во время фазы их логарифмического роста (1.5 × 10 6 паразитов / мл) при 26 ° C. Поздние стационарные промастиготы были получены после инкубации паразитов в течение 5–6 дней с исходным инокулятом 1 × 10 6 паразитов / мл. Leishmania аксенических амастигот были получены при pH 5,0 в культуральной среде Шнайдера после ступенчатого повышения температуры до 30, 31 и 32 ° C, за исключением амастигот L. infantum , которые подвергались воздействию 34, 36 и 37 ° C, поскольку описано ранее [42].
Анализ ингибирования роста
Антилейшманиальную активность в промастиготах и аксенных амастиготах определяли с использованием гидрата XTT (натрий 3,3 ‘- [1- (фениламинокарбонил) -3,4-тетразолий] -бис (4-метокси-6-нитро) бензолсульфоновой кислоты ) набор для пролиферации клеток (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), как описано ранее [42], [43].Клетки ресуспендировали в содержащей FBS культуральной среде RPMI-1640 (1,5 × 10 6 клеток / мл для промастигот и 2 × 10 6 клеток / мл для аксенических амастигот) и высевали (100 мкл / лунку) в 96 мкл / лунку. -луночные планшеты с плоским дном для микротитрования при 26 ° C, в отсутствие и в присутствии различных концентраций указанных ALP. После 72-часовой инкубации при 26 ° C для каждого соединения определяли значения IC 50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация), определяемые как концентрация лекарственного средства, вызывающая 50% ингибирование пролиферации клеток по сравнению с необработанными контролями.Измерения проводили в трех экземплярах, и каждый эксперимент повторяли четыре раза.
Анализ апоптозоподобной гибели клеток методом проточной цитометрии
Полтора миллиона Leishmania spp. промастигот или аксенических амастигот обрабатывали в отсутствие и в присутствии указанных концентраций ЩФ в течение разного времени инкубации. Затем паразитов осаждали центрифугированием (1000 × г, ) в течение 5 минут и анализировали на апоптозоподобное разрушение ДНК с помощью проточной цитометрии, следуя протоколу, описанному ранее [44].Количество апопто-подобных клеток отслеживали как процент клеток в области sub-G 0 / G 1 (гиподиплоидия) в анализе клеточного цикла [44], [45], используя сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS) Проточный цитометр Calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), оснащенный аргоновым лазером 488 нм. Для анализа данных использовалось программное обеспечение WinMDI 2.8.
Внутриклеточное распределение флуоресцентного аналога эдельфозина в
макрофагах J774, инфицированных L. panamensisЛиния макрофагоподобных клеток мыши J774, выращенная в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, при 37 ° C в увлажненной среде 95. % воздуха и 5% CO 2 , инфицировали в течение ночи в экспоненциальной фазе роста (3 × 10 5 клеток / мл) стационарной фазой л.panamensis , при соотношении макрочастиц / промастигот 1/10 в полной культуральной среде RPMI-1640. Неинтернализованные промастиготы удаляли 2–3 последовательными промываниями PBS. Затем неинфицированные и -инфицированные L. panamensis макрофаги J774 инкубировали в течение 1 ч с 10 мкМ флуоресцентного аналога эдельфозина all- (E) -1- O — (15′-фенилпентадека-8 ‘, 10’, 12 ‘, 14’-тетраенил) -2- O -метил- rac -глицеро-3-фосфохолин (PTE-ET) [34], [46], [47] (любезно предоставлено F.Амат-Герри и А.У. Acuña, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Мадрид, Испания) в полной культуральной среде RPMI-1640. Кроме того, клетки J774 также сначала инкубировали с 10 мкМ PTE-ET в течение 1 часа, затем промывали PBS и инфицировали L. panamensis в темноте в течение 6 часов. Образцы фиксировали 1% формальдегидом и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss GmbH, Оберкохен, Германия) (40-кратное увеличение).
Оценка внутриклеточной паразитарной нагрузки в макрофагоподобных клетках
клеток J774 инфицировали L.panamensis , как указано выше. Число внутриклеточных жизнеспособных паразитов оценивали путем инкубации инфицированных клеток со средой RPMI-1640, содержащей 0,008% SDS, для мягкого разрушения плазматической мембраны макрофагов, с последующим добавлением культуральной среды RPMI-1640, содержащей 20% FBS, для остановки дальнейшего лизиса. Затем образцы последовательно разбавляли в 96-луночных планшетах, содержащих двухфазную среду Novy-MacNeal-Nicolle (NNN). Планшеты инкубировали при 26 ° C в течение 20 дней и еженедельно исследовали под инвертированным микроскопом Nikon TS-100 (Nikon, Канагава, Япония) для оценки присутствия жизнеспособных подвижных промастигот.Концентрация паразитов считалась обратной величиной самого высокого разведения, положительного для роста паразитов.
Определение оксида азота (NO) методом нитрита
Макрофагоподобные клетки J774 помещали в полную культуральную среду RPMI-1640 в концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку в 24-луночные культуральные планшеты (Costar, Кембридж, Массачусетс) и давали им закрепиться в течение 2 часов при 37 ° C в 5% CO 2 . Неприкрепленные клетки удаляли осторожной промывкой полной культуральной средой RPMI-1640.Прилипшие клетки J774 инкубировали в отсутствие (отрицательный контроль) или в присутствии 10 мкг / мл липополисахарида (Sigma, Сент-Луис, Миссури) (LPS; положительный контроль) или различных концентраций эдельфозина. После 18-часовой инкубации при 37 ° C в 5% CO 2 супернатанты собирали, центрифугировали при 500 × g в течение 10 минут и хранили при -80 ° C до анализа. Высвобождение NO косвенно измеряли с помощью колориметрического анализа, основанного на реакции Грисса. Трехкратные аликвоты по 100 мкл супернатантов клеточных культур инкубировали с 50 мкл свежеприготовленного реагента Грисса (1% сульфаниламид, 0.1% дигидрохлорида нафтилэтилендиамида и 2,5% ортофосфорной кислоты) в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем измеряли поглощение азохромофора при 550 нм. Концентрацию нитрита определяли с использованием нитрита натрия в качестве стандарта. Все образцы анализировали против холостого опыта, содержащего полную культуральную среду RPMI-1640, инкубируемую в течение 18 часов на тех же планшетах, что и образцы, но в отсутствие клеток. Все реагенты были приобретены у Sigma. Результаты были выражены в наномолях нитрита на 10 6 макрофагов.
Оценка антилейшманиальной активности на моделях мышей и хомяков
Шестинедельные самки мышей BALB / c (18-20 г) и четырехнедельные самцы сирийских золотых хомяков ( Mesocricetus auratus ) (около 120 г) (Charles River Laboratories, Лион, Франция), содержатся в в учреждении, свободном от патогенов и обслуживаемом в соответствии с институциональными руководящими принципами, в соответствии с испанским законодательством при 12/12-часовом цикле свет / темнота при температуре 22 ° C, получали стандартную диету и воду ad libitum .Мышам привили подкожно. в подушечку левой задней лапы (в общем объеме 50 мкл PBS) 2 × 10 6 инфекционных промастигот в стационарной фазе, тогда как хомякам, предварительно анестезированным ингаляционным фораном, внутрикожно в нос вводили 1 × 10 6 промастиготов стационарной фазы в объеме 50 мкл PBS. Когда воспаление было очевидным (около 1 недели у мышей и 6 недель у хомяков после инокуляции), животных случайным образом распределяли на группы по 7 животных в каждой, получая ежедневное пероральное введение (через иглу для кормления) эдельфозина (15 мг / кг). для мышей и 26 мг / кг для хомяков в воде) или равный объем носителя (воды).У мышей толщину подушечек стопы измеряли штангенциркулем каждую неделю и сравнивали с неинфицированной подушечкой правой задней лапы, чтобы получить чистое увеличение отека подушечки стопы. У хомяков отек носа измеряли штангенциркулем каждую неделю и сравнивали с размером носа до инокуляции и лечения. Индекс развития поражения рассчитывали как размер поражения во время лечения (мм) / размер поражения до лечения. Проверяли массу тела животного и любые признаки заболеваемости. Медикаментозное лечение длилось 28 дней, и животных умерщвляли в соответствии с инструкциями учреждения, через 24 часа после последнего введения лекарства.
После умерщвления животных количество паразитов в инфицированных тканях определяли с помощью анализов предельного разведения, как описано ранее [48]. Биопсии промывали 3 раза PBS с добавлением 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (GIBCO-BRL), а затем инкубировали в течение ночи (12 ч) при 4 ° C с PBS, содержащим 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг. / мл стрептомицина. После инкубации в течение ночи биопсии промывали 2–3 раза PBS с добавлением вышеуказанных антибиотиков, а затем взвешенный кусок инфицированной области гомогенизировали в 1 мл PBS, содержащего антибиотики, с использованием стерильного стеклянного измельчителя тканей типа Potter-Elvejhem.Гомогенат разводили до конечной концентрации 0,1 мг / мл в культуральной среде Шнайдера, содержащей 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина; а затем производили серийные разведения в трех экземплярах в 96-луночных планшетах, содержащих двухфазную среду Novy-MacNeal-Nicolle (NNN). Планшеты инкубировали при 26 ° C в течение 20 дней и еженедельно исследовали под инвертированным микроскопом Nikon TS-100 для оценки наличия жизнеспособных промастигот. Обратной величиной наибольшего разведения, положительного для роста паразитов, считалась концентрация паразитов на мг ткани.Общую паразитарную нагрузку рассчитывали, используя общий вес соответствующего инфицированного органа.
Индукция
in vitro устойчивости к глюкантиму у промастигот L. panamensisПаразитов, культивированных в культуральной среде Шнайдера с добавлением 10% FBS, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 26 ° C в течение 5 дней, дважды промывали PBS и центрифугировали при 1000 × g в течение 10 минут. при комнатной температуре. Затем паразитов ресуспендировали при 2 × 10 6 промастигот / мл в культуральной среде Шнайдера и инкубировали при 26 ° C в течение 5 дней с 4 мг / мл глюкантима (Aventis Pharma, Сан-Паулу, Бразилия), что соответствовало его IC . 50 , ранее оцененное методом XTT.Культуральную среду, содержащую лекарственное средство, меняли каждые 4–6 дней, в зависимости от роста паразитов, и паразитов промывали PBS, анализировали с помощью анализа XTT и снова ресуспендировали при 2 × 10 6 паразитов / мл. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока жизнеспособность паразитов в присутствии препарата не превысила 80%. Затем, после достижения этой скорости жизнеспособности, этот процесс повторяли три раза с увеличением концентрации SbV до достижения конечной концентрации 37 мг / мл. Объем раствора лекарственного средства, используемого в каждом пассаже, контролировали так, чтобы он не превышал 10% от общего объема питательной среды.
Оценка устойчивости
L. panamensis к SbV на модели хомякаУровень устойчивости к SbV дополнительно оценивали путем инфицирования золотистых хомячков вышеуказанными in vitro -генерированными SbV-устойчивыми (SbV-R) L. panamensis паразитами, растущими в присутствии 37 мг / мл SbV, т.к. а также с чувствительным L. panamensis дикого типа с последующей обработкой Glucantime. Хомяков разделили на две группы: восемь животных, инфицированных устойчивым штаммом, и восемь животных, инфицированных чувствительным штаммом.Каждой группе внутрикожно вводили в нос 1 × 10 6 промастигот стационарной фазы в объеме 50 мкл PBS. Эти животные были предварительно анестезированы кетамином (50 мг / мл) и ксилазином (5 мг / кг) внутрибрюшинно. Приблизительно через шесть недель после заражения поражения были очевидны в обеих группах животных, и животных лечили ежедневно 40 мг / кг глюкантима внутримышечно с использованием иглы 27-го размера в течение десяти дней. Развитие поражений и эффективность лекарства отслеживали, как указано выше.
Индукция
in vitro устойчивости к ЩФ у различных Leishmania видовALP-устойчивых Leishmania штаммов были получены, как указано выше, для устойчивых к SbV паразитов. Лекарства сначала инкубировали при их соответствующих значениях IC 50 , а затем концентрацию лекарства постепенно увеличивали. Паразиты считались устойчивыми, если они могли расти при концентрации лекарства 30 мкМ.
Статистический анализ
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.Статистические различия между группами оценивали с помощью теста Манна-Уитни или критерия Стьюдента t . Статистически значимым считалось значение P <0,05.
Результаты
ЩФ дифференциально подавляют пролиферацию
Leishmania spp. промастиготМы проанализировали антилейшманиальный потенциал четырех наиболее клинически значимых ЩФ, а именно эдельфозина, милтефозина, перифозина и эруцилфосфохолина (рис. 1).Используя анализ XTT, мы обнаружили, что эдельфозин и перифозин были наиболее активными ALP, ингибирующими пролиферацию различных Leishmania spp. промастигот со значениями IC 50 в диапазоне низких микромолярных концентраций (∼2–9 мкМ) в большинстве случаев ( L. donovani , L. panamensis , L. mexicana , L. major , L. amazonensis ) (табл.1). Промастиготы L. braziliensis и L. infantum были более устойчивы к действию эдельфозина, перифозина и милтефозина, чем другие протестированные виды Leishmania (Таблица 1).Эруцилфосфохолин оказался наименее эффективным ЩФ в ингибировании пролиферации паразитов в отношении большинства Leishmania spp. промастигот, но, что интересно, он показал самую высокую противопаразитарную активность против промастигот L. infantum (Таблица 1). В целом, по антилейшманиозной активности отдельных ЩФ эдельфозин ≥ перифозин> милтефозин> эруцилфосфохолин против Leishmania spp. промастигот.
Влияние ЩФ на ингибирование пролиферации
Leishmania spp.аксенические амастиготыЗатем мы проанализировали антилейшманиальную активность отдельных ЩФ против отдельных аксенических амастигот Leishmania . После скрининга препаратов аксенических амастигот мы обнаружили, что эдельфозин и перифозин действуют как наиболее эффективные ЩФ в ингибировании пролиферации отдельных Leishmania spp. амастигот (таблица 1). Для амастигот был обнаружен более широкий диапазон значений IC 50 , чем для промастиготных форм Leishmania (таблица 1).Значения IC 50 амастиготной активности адельфозина и перифозина против Leishmania находились в диапазоне от 3–12 мкМ до 2–15 мкМ, соответственно. Милтефозин показал более высокую степень вариабельности (IC 50 , ∼4–39 мкМ), при этом амастигот L. panamensis были достаточно устойчивыми (IC 50 , 39,3 мкМ) (Таблица 1). Эруцилфосфохолин показал самые высокие значения IC 50 (∼28–66 мкМ) для ингибирования роста клеток у всех Leishmania spp.Проанализировано амастигот (табл. 1). Удивительно, но амастигот L. infantum были очень чувствительны к действию перифозина, эдельфозина и милтефозина, тогда как родственные им формы промастигот были довольно устойчивыми (таблица 1), с двузначными цифрами IC 50 для промастигот и низкими однозначными значениями IC 50 значений для амастигот. Интересно, что амастиготы L. braziliensis были гораздо более чувствительны к эдельфозину и милтефозину, чем их аналоги промастигот (таблица 1), тогда как перифозин и эруцилфосфохолин показали аналогичные значения IC 50 для обоих L.braziliensis формы промастигот и амастигот с IC 50 фигурами более 14 мкМ (Таблица 1). В целом, по антилейшманиозной активности отдельных ЩФ эдельфозин ≥ перифозин> милтефозин> эруцилфосфохолин против Leishmania spp. амастигот. Эти результаты показывают, что чувствительность паразитов Leishmania к ЩФ сильно зависит от каждого вида, а также от их стадийной формы, а именно промастиготы или амастиготы. Интересно, потому что мы недавно обнаружили, что уровень эдельфозина в плазме после ежедневного перорального приема 30 мг / кг составлял около 10.3–25,2 мкМ как у BALB / c, так и у мышей с иммунодефицитом [29], [30], [49], доза, которая была эффективна в подавлении роста раковых клеток in vivo [29], [30], [50], наши результаты показывают, что эдельфозин был активен против всех Leishmania spp. протестирован в фармакологически значимых концентрациях (Таблица 1).
Эдельфозин является наиболее мощной ЩФ в индукции апоптозоподобной гибели клеток у
Leishmania промастиготПриведенные выше результаты показали, что ЩФ способны ингибировать Leishmania spp., быстрое распространение. Затем мы проанализировали, способны ли эти агенты, используемые в фармакологически релевантной концентрации 10 мкМ, вызывать апоптозную гибель клеток у Leishmania spp. промастигот путем определения фрагментации ДНК с помощью проточной цитометрии. Паразиты, демонстрирующие содержание гиподиплоидной ДНК суб-G 0 / G 1 , представляют собой клетки, которые подвергаются разрушению ДНК и апоптозной гибели клеток [51]. Мы обнаружили, что эдельфозин является наиболее активной ЩФ в обеспечении мощного апоптозного ответа у всех Leishmania spp. (рис. 2А). Практически полное отсутствие апоптотического ответа у промастигот L. infantum (рис. 2А) было ожидаемым, так как ЩФ использовались в концентрации 10 мкМ, что ниже значения IC 50 для ингибирования пролиферации промастигот L. infantum , измеренного с помощью XTT. анализы (таблица 1). Интересно, что эдельфозин показал гораздо более высокую проапоптотическую активность против промастигот L. donovani и L. mexicana , чем милтефозин и перифозин (рис. 2A), несмотря на аналогичные значения IC 50 (∼2–3 мкМ) для три ALP, оцененные с помощью анализов XTT (таблица 1).Эти результаты предполагают, что индукция гибели клеток эдельфозином может несколько отличаться от того, каким образом милтефозин и перифозин способствуют уничтожению паразитов. Способность отдельных ЩФ вызывать апоптозную гибель клеток у Leishmania spp. промастигот оценили эдельфозин> перифозин≅милтефозин> эруцилфосфохолин. Результаты, показанные на фиг. 2A, также показывают, что способность эдельфозина способствовать апоптозной гибели клеток в значительной степени зависит от подрода Leishmania .В связи с этим, эдельфозин подавлял пролиферацию промастигот L. amazonensis (sug-род Leishmania ) и L. braziliensis (sug-род Viannia ) при значениях XTT IC 50 µM, равных 6,4 и 18,3 мкМ соответственно. (Таблица 1), но процент паразитов с содержанием гиподиплоидной ДНК суб-G 0 / G 1 был выше у L. braziliensis , чем у промастигот L. amazonensis (Рисунок 2A).
Рисунок 2.Дифференциальная способность ЩФ индуцировать апоптозную гибель клеток у Leishmania spp.
(A) Промастиготы из разных Leishmania spp. обрабатывали 10 мкМ эдельфозином, милтефозином, перифозином или эруцилфосфохолином (ErPC) при 26 ° C в течение 24 часов. Затем с помощью проточной цитометрии количественно определяли гибель клеток, подобную апоптозу, как процент паразитов в суб-G 0 / G 1 области. (B) промастиготов L. infantum инкубировали с различными концентрациями эдельфозина, милтефозина, перифозина и эруцилфосфохолина (ErPC) при 26 ° C в течение 24 часов, а затем с помощью проточной цитометрии определяли гибель клеток, подобную апоптозу.(C) Репрезентативные гистограммы анализа клеточного цикла промастигот L. panamensis , обработанных 5 и 10 мкМ эдельфозином и милтефозином в разное время инкубации. Положение пика суб-G 0 / G 1 , интегрированного паразитами, подвергающимися апоптозоподобной гибели клеток, указано стрелками. Процент апоптотических паразитов показан на каждой гистограмме. (D) Промастиготы L. panamensis обрабатывали 5 и 10 мкМ эдельфозином или милтефозином в разное время инкубации, а затем определяли апоптозоподобную гибель клеток с помощью проточной цитометрии.Необработанные Leishmania промастиготов обрабатывались параллельно, и гибель клеток, подобная апоптозу, составляла менее 1,5% у необработанных паразитов во всех случаях, показанных на панелях A – D. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение или репрезентативные для четырех независимых экспериментов. Звездочки указывают на то, что различия между клетками, обработанными эдельфозином и милтефозином, являются статистически значимыми. (*) P <0,05. (**) P <0,01.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612.g002
Промастиготы L. infantum вели себя несколько иначе, чем другие виды Leishmania , в отношении их чувствительности к апоптозоподобной гибели клеток под действием ЩФ, требующей высоких концентраций ЩФ. Дозозависимый анализ апоптотической реакции промастигот L. infantum на четыре испытанных ЩФ соответствовал приведенным выше значениям XTT IC 50 для соответствующих лекарств (см. Рисунок 2B и Таблицу 1), при этом эруцилфосфохолин как наиболее эффективный ЩФ при 30 мкМ (рис. 2В).Однако при более высоких концентрациях эдельфозин становился столь же эффективным, как эруцилфосфохолин, в провоцировании апоптотозоподобной гибели клеток у промастигот L. infantum (рис. 2В).
Сравнительный анализ зависимости реакции от дозы показал, что эдельфозин более эффективен, чем милтефозин, в индукции апоптозоподобной гибели клеток у промастигот L. panamensis (рис. 2, C и D), причем эдельфозин очень эффективен даже при 5 мкМ. Эти результаты согласуются с нашими приведенными выше данными по фигурам XTT IC 50 (Таблица 1).Профили клеточного цикла промастигот L. panamensis , окрашенных пропидиумом иодидом, показали высокий процент паразитов с апоптозоподобным разрушением ДНК после лечения эдельфозином в дозах 5 или 10 мкМ (рис. 2, C и D), тогда как милтефозин вызывал только значительный ответ разрушения ДНК при 10 мкМ (рис. 2, C и D). Интересно, что эдельфозин также индуцировал апоптозоподобную гибель клеток у аксенических амастигот L. panamensis (25,8 ± 4,6 и 55,4 ± 2,8% sub-G 0 / G 1 клеток ( n = 3) после 24 ч инкубации. с 10 и 20 мкМ эдельфозином соответственно).
Эдельфозин накапливается во внутриклеточных
Leishmania паразитовПоскольку паразиты Leishmania используют макрофаги в качестве основной клетки-хозяина при инфекции млекопитающих, мы затем проанализировали локализацию эдельфозина в макрофагах, инфицированных Leishmania . С этой целью мы использовали флуоресцентный аналог эдельфозина all — ( E ) -1- O — (15′-фенилпентадека-8 ′, 10 ′, 12 ′, 14′-тетраенил) -2- . O -метил- rac -глицеро-3-фосфохолин (PTE-ET), который ранее использовался в качестве соединения bona fide для анализа субклеточной локализации эделфозина в раковых клетках [30], [34], [46], [52], [53], и полностью имитирует противоопухолевое [30], [34], [46], [52], [53] и антилейшманическое [54] (данные не показаны) действия исходный препарат эдельфозин.Линия клеток мышиных макрофагов J774 была довольно устойчивой к апоптозу после обработки эдельфозином (IC 50 = 40,7 ± 7,1 мкМ, по оценке XTT-анализа), и поэтому ее использовали в качестве линии клеток-хозяев для инфекции Leishmania . . Эдельфозин (10 мкМ) был неспособен индуцировать апоптоз в клетках J774 после 24 часов инкубации (<2% апоптоза) и вызывал менее 15% апоптоза после 48 часов инкубации. Это резко контрастирует с высокой чувствительностью других моноцитоподобных клеточных линий к эдельфозину, таких как клетки U937 человека [28], [55], [56], которые подвергаются быстрому апоптозу и поэтому не могут использоваться в качестве клеток-хозяев для проанализировать влияние ЩФ на внутриклеточных паразитов, проживающих в макрофагах.Инкубация макрофагов J774 с PTE-ET показала, что флуоресцентный аналог эдельфозина попал в клетку (рис. 3А). Голубая флуоресценция PTE-ET в основном локализовалась вокруг ядра (рис. 3A, левая панель), что может быть связано с преимущественным накоплением этого эфирного липида в эндоплазматическом ретикулуме клеток J774, как ранее сообщалось для солидных опухолевых клеток [50]. , [52]. Когда макрофаги были инфицированы паразитами L. panamensis , у внутриклеточных паразитов была обнаружена интенсивная синяя флуоресценция (рис. 3A, средняя панель), что указывает на то, что основное местоположение флуоресцентного соединения PTE-ET оказалось во внутриклеточных паразитах. внутри макрофага.Расположение PTE-ET у паразитов, проживающих в макрофагах, было четко определено независимо от того, инкубировали ли PTE-ET с макрофагами, ранее инфицированными паразитами (рис. 3A, средняя панель), или с интактными макрофагами, а затем инкубировали с паразитами (рис. 3А, правая панель). Макрофаги, содержащие небольшое количество амастигот Leishmania , показаны на рисунке 3, чтобы облегчить визуализацию расположения флуоресцентного препарата у паразитов (рисунок 3A).Аналогичные данные были получены с первичными макрофагами, происходящими из костного мозга мыши, которые были устойчивы к 10 мкМ эдельфозину после инфицирования L. major (данные не показаны). Эти данные предполагают, что адельфозин накапливается в внутриклеточных паразитах Leishmania внутри макрофагов, подобно PTE-ET, чтобы оказывать свое антипаразитарное действие независимо от того, проводится ли лекарственное лечение до или после инфекции.
Рисунок 3. Антилейшманиальная активность эдельфозина против внутриклеточных амастигот Leishmania в макрофагоподобных клетках J774.
(A) Клетки J774, инкубированные с синим флуоресцентным аналогом PTE-ET ( левая панель ) или с L. panamensis ( Lp ), а затем с PTE-ET ( средняя панель ) , или с PTE-ET, а затем с L. panamensis ( Lp ) (правая панель), анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии для изучения локализации лекарственного средства. Белые стрелки указывают на внутриклеточные амастиготы. (B) Бремя паразитов в инфицированных L. panamensis клеток J774, необработанных (контроль) и обработанных 5 или 10 мкМ эдельфозином в течение 24 часов.Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение или репрезентативные для четырех независимых экспериментов. Звездочки указывают на то, что различия между контрольной группой и группами, получавшими эдельфозин, статистически значимы. (*) P <0,05. (**) P <0,01.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612.g003
Эдельфозин вызывает гибель клеток
Leishmania амастигот внутри макрофаговМы также обнаружили, что эдельфозин эффективно убивает L., находящиеся в макрофагах J774.panamensis , исследуя паразитарную нагрузку макрофагов с помощью анализов предельного разведения (рис. 3В). Цитотоксическое действие эдельфозина против внутриклеточных амастигот L. panamensis было дополнительно подтверждено резким снижением количества внутриклеточных паразитов с использованием макрофагов J774, инфицированных зеленым флуоресцентным L. panamensis , ранее трансфицированных p.6.5-egfp для экспрессии. зеленый флуоресцентный белок (GFP) [57] (данные не показаны).
Предполагается, что некоторые противопаразитарные препараты усиливают свое действие за счет образования оксида азота (NO) [58], поскольку эта молекула оказывает важное антипаразитарное действие [59], [60].Сообщалось, что милтефозин индуцирует NO в клетках U937 [61]. Однако нам не удалось обнаружить продукцию NO после инкубации 10 мкМ эдельфозина с макрофагами J774 (<2 нмоль нитритов / 10 6 клеток J774 после 18 ч инкубации), в отличие от инкубации клеток с 10 мкг / мл LPS (100 нмоль нитритов / 10 6 клеток J774 после 18 ч инкубации). Точно так же лечение адельфозином не способствовало синтезу NO в макрофагах, происходящих из костного мозга мыши, и альвеолярных макрофагах крысы (данные не показаны).Эти данные предполагают, что убивающий эффект эдельфозина на макрофагальных паразитов Leishmania не зависит от генерации NO.
In vivo антилейшманиальная активность эдельфозина на модели мышиЗатем мы исследовали антилейшманиальную активность in vivo эдельфозина у мышей BALB / c, инфицированных подкожно в подушечку лапы 2 × 10 6 инфекционных промастигот в стационарной фазе L. major . В соответствии с предыдущими оценками [29], [30], [49], мы обнаружили, что ежедневное пероральное введение 15 или 30 мг / кг эдельфозина хорошо переносится, 45 мг / кг является максимальной переносимой дозой, после анализа токсичности, где животных наблюдали на предмет потери массы тела или каких-либо заметных побочных эффектов, включая изменения силы и общего состояния (данные не показаны).Мы обнаружили, что ежедневная доза для перорального введения, равная 15 мг / кг массы тела эдельфозина, приводит к значительному подавлению воспаления подушечек стопы (Рисунок 4A) и паразитарной нагрузки (Рисунок 4B), что оценивается с помощью штангенциркуля, измеряющего набухание подушечек стопы, и анализов предельного разведения, соответственно. , в конце 28-дневного периода лечения. В сравнительных экспериментах мы обнаружили, что пероральное лечение мышей BALB / c, инфицированных L. major , эдельфозином было немного более эффективным, чем милтефозин, хотя различия не были статистически значимыми (данные не показаны).Доза эдельфозина, используемая в наших анализах, была аналогична дозе, используемой для милтефозина на моделях мышей, в диапазоне от 2,5 до 25 мг / кг массы тела / день при пероральном приеме, и составляла 20 мг / кг / день, наиболее широко используемая доза для in vivo экспериментов на мышах [35], [39], [62] — [65]. Кроме того, поскольку молекулярные массы эдельфозина и милтефозина составляют 523,7 и 407,6 соответственно, доза эдельфозина, использованная в наших анализах (15 мг / кг, что соответствует 28,6 мкмоль / кг), была даже ниже, чем обычная доза милтефозина (20 мг / кг). кг, что соответствует 49.1 мкмоль / кг) в этих исследованиях in vivo на мышах.
Рисунок 4. In vivo антилейшманиальное действие эдельфозина у мышей, инфицированных L. major .
Мышей BALB / c инфицировали 2 × 10 6 промастиготами L. major в подушечке левой задней лапы, и после того, как стало заметно набухание, мышей рандомизировали в группы, получавшие лекарственное средство (15 мг эдельфозина / кг массы тела, ежедневное пероральное введение в течение 28 дней) и контрольную (водный носитель) группы по 7 мышей в каждой.После завершения 4-недельного лечения поражения оценивали путем измерения припухлости подушечек стопы (A) и определения паразитарной нагрузки (B), используя измерения штангенциркулем и анализы предельного разведения соответственно. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 7). Звездочки указывают на то, что различия между контрольной группой и группами, получавшими эдельфозин, статистически значимы. (**) P <0,01.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612.g004
In vivo антилейшманиозная активность эдельфозина на моделях кожных и слизисто-кожных хомяков лейшманиозЗатем мы использовали золотых хомяков в качестве дополнительной экспериментальной животной модели лейшманиоза.Сообщалось, что хомяки лучше воспроизводят клинико-патологические особенности лейшманиоза человека, чем мыши [66] — [68]. Один миллион промастигот L. panamensis и L. braziliensis был инокулирован в нос золотых хомяков в качестве животных моделей кожного и кожно-слизистого лейшманиоза, поскольку указанные выше виды Leishmania могут вызывать как кожные, так и кожно-слизистые заболевания [69] , [70]. Затем хомяков случайным образом разделили на группы, получавшие лечение и не принимавшие лекарства (водный носитель), по семь хомяков в каждой, и модели животных для л.panamensis (рис. 5, A – C) и L. braziliensis (рис. 5, D – F) отслеживали антилейшманиозную эффективность эдельфозина. Для определения скорости отека носа были проведены серийные измерения штангенциркулем в ходе анализов (рис. 5, A и D). Развитие болезни привело к резкому отеку и изъязвлению носа. Пероральное введение эдельфозина (26 мг / кг массы тела) ежедневно в течение 4 недель (28 дней) вызывало заметное уменьшение как отека носа, так и паразитарной нагрузки в очаге инфекции (рис. 5).Эта доза ниже, чем доза милтефозина (40 мг / кг / день), использованная в недавнем исследовании с хомяков, инфицированных L. donovani [71]. Здесь мы не обнаружили заметных побочных эффектов на общее состояние животных после ежедневного перорального приема адельфозина в дозе 26 мг / кг. Влияние эдельфозина на отек носа стало очевидным при инфекциях L. panamensis и L. braziliensis после двух недель лечения (рис. 5, A и D). Нагрузки паразитов, оцененные с помощью анализов предельного разведения, были значительно уменьшены в обеих моделях животных после перорального лечения эдельфозином (рис. 5, B и E).У необработанных инфицированных животных наблюдались сильные опухоли и изъязвления в носу, но лечение эдельфозином значительно облегчило симптомы лейшманиоза (рис. 5, E и F).
Рисунок 5. In vivo антилейшманиальное действие эдельфозина на хомяков, инфицированных L. panamensis и L. braziliensis .
Золотые хомячки были инфицированы промастиготами 1 × 10 6 L. panamensis или L. braziliensis в носу, и после того, как стал заметен отек, хомяков рандомизировали в группы, принимавшие лекарства (26 мг эдельфозина / кг тела). веса, ежедневное пероральное введение в течение 28 дней) и контрольная (водный носитель) группы по 7 хомяков в каждой.(A, D) Развитие поражения контролировали путем измерения толщины носа через регулярные промежутки времени и сравнения со значениями, полученными до лечения (индекс эволюции). (B, E) Количество паразитов определяли с помощью анализов предельного разведения после завершения 4-недельных анализов in vivo . Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 7). Звездочки указывают на то, что различия между контрольной группой и группами, получавшими эдельфозин, статистически значимы. (*) P <0,05. (**) P <0.01. (C, F) Лечение эдельфозином привело к резкому уменьшению и улучшению вызванной паразитами толщины носа и повреждений, как показано на репрезентативных фотографиях хомяков из контрольной группы и хомяков, получавших адельфозин.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612.g005
Эдельфозин проявляет сильную
in vitro и in vivo антилейшманиальную активность против SbV-устойчивых паразитов L. panamensisКожный лейшманиоз является наиболее распространенной формой лейшманиоза и эндемичен во многих тропических и субтропических странах [1], [2].Обычные методы лечения лейшманиоза на протяжении более 60 лет включают использование препаратов SbV в виде антимониата меглумина (глюкантайм) или стибоглюконата натрия (пентостам) [2], [72]. Однако широкое использование этих соединений приводит к устойчивости к SbV. Таким образом, паразиты приобрели устойчивость к сурьме во многих частях мира, а первичная устойчивость к SbV превышает 60% случаев лейшманиоза в штате Бихар в Индии [73]. Было показано, что различные виды Leishmania демонстрируют отчетливую восприимчивость к сурьмянам [74], [75].Кроме того, сообщалось, что чувствительность L. donovani к SbV следует за стадиями трансформации промастиготов в аксенические амастиготы, тогда как устойчивость к SbV приобретается, когда амастиготы дифференцируются в промастиготы [76]. Сообщается также, что SbV активен, хотя и в разной степени, против ряда Leishmania spp. промастигот и амастигот in vitro , в том числе L. panamensis [77] — [81]. На этом основании и из-за возможных клинических последствий мы создали устойчивый к SbV L.panamensis для тестирования на противопаразитарную активность отдельных ЩФ. Индукция устойчивости к SbV у промастигот L. panamensis была достигнута путем непрерывного воздействия на этих паразитов in vitro увеличивающихся концентраций Glucantime в течение 1 года. Устойчивый к SbV штамм L. panamensis был способен противостоять концентрациям Glucantime до 36 мг / мл, по оценке XTT-анализа, концентрации в 9 раз выше, чем IC 50 (4 мг / мл) для дикий тип L.panamensis промастиготы. Из-за различной чувствительности к SbV, проявляемой некоторыми Leishmania spp. , в зависимости от стадии промастиготы или амастиготы, устойчивость к SbV промастигот L. panamensis дополнительно оценивали с помощью экспериментов in vivo на модели хомяка. Две группы по восемь хомяков в каждой были привиты в нос промастиготами L. panamensis дикого типа и устойчивыми к SbV, а затем, после 6-недельного постинфекционного периода, когда опухоль носа была отчетливо обнаружена, хомячкам внутримышечно вводили 40 мг / кг массы тела Glucantime (SbV) ежедневно в течение 4 недель.Как показано на Фигуре 6 (A и B), отек уменьшился у животных, инфицированных L. panamensis дикого типа , но увеличился у животных, инфицированных устойчивым к SbV L. panamensis . Кроме того, макрофаги, инфицированные амастиготами Leishmania , легко наблюдались в мазках из носа хомяков, устойчивых к SbV L. panamensis , но не от животных, инфицированных L. panamensis дикого типа, получавших SbV (рис. 6Б). Более того, паразитарная нагрузка в носу у двух групп животных указала на то, что количество жизнеспособных животных дикого типа L.panamensis резко уменьшилось после обработки пятивалентным препаратом сурьмы, но устойчивые к SbV паразиты L. panamensis оставались жизнеспособными в анализе in vivo (данные не показаны). Эти результаты показывают, что созданный устойчивый к SbV штамм L. panamensis обладал высокой устойчивостью к обработке пятивалентной сурьмой как in vitro , так и in vivo .
Рисунок 6. Чувствительность устойчивых к SbV паразитов L. panamensis к эдельфозину.
(A) Две группы по восемь золотых хомячков в каждой были инфицированы в носу промастиготами L. panamensis ( Lp ) дикого типа и устойчивыми к SbV , и через шестую неделю после заражения их лечили ежедневное внутримышечное введение Glucantime (SbV) в течение 4 недель. Скорость развития болезни измерялась на протяжении всего процесса путем определения толщины носа по сравнению с цифрами, полученными до заражения. (B) Золотые хомячки, инокулированные SbV-устойчивым (SbV-R) L.panamensis ( Lp ) не реагировал на лечение Glucantime (воспаленный нос) (верхняя левая панель), а мазки из носа показали амастиготы в макрофагах (стрелка) после окрашивания по Гимзе (нижняя левая панель). Однако хомячки, инфицированные диким типом (wt) L. panamensis ( Lp ), полностью ответили на лечение Glucantime, показывая незаженный нос и отрицательное окрашивание на амастиготы в мазках из носа (верхняя и нижняя правая панели). (C) IC 50 значения эдельфозина, милтефозина, перифозина и эруцилфосфохолина (ErPC) для in vitro ингибирование роста дикого типа (wt) и устойчивого к SbV (SbV-R) л.panamensis ( Lp ) определяли с помощью анализа XTT. (D – F) Золотые хомяки были инфицированы 1 × 10 6 SbV-устойчивых промастигот L. panamensis в носу, и после того, как воспаление носа стало очевидным, хомяков рандомизировали в группы, принимавшие лекарство (26 мг эдельфозина / кг). масса тела, ежедневное пероральное введение в течение 28 дней) и контрольные (водный носитель) группы по 7 хомяков в каждой. (D) Развитие поражения контролировали путем измерения толщины носа через регулярные промежутки времени и сравнения со значениями, полученными до лечения (индекс эволюции).(E) Количество паразитов определяли с помощью анализов предельного разведения после завершения 4-недельного анализа in vivo . (F) Лечение эдельфозином привело к резкому уменьшению и уменьшению вызванной паразитами толщины носа и повреждений, как показано на фотографиях хомяков из контрольной группы, не принимавших лекарственные препараты, и хомяков, получавших адельфозин. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение или репрезентативные эксперименты ( n = 7). Звездочки указывают на то, что различия между контрольной группой и группами, получавшими эдельфозин, или между паразитами дикого типа и устойчивыми к SbV паразитами, получавшими SbV, являются статистически значимыми.(*) P <0,05. (**) P <0,01.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001612.g006
Затем мы протестировали in vitro на активность четырех ALP: эдельфозина, милтефозина, перифозина и эруцилфосфохолина против л как дикого типа, так и устойчивого к SbV. y.panamensis промастигот по данным анализа XTT. Мы обнаружили, что все ЩФ были эффективны в подавлении пролиферации SbV-устойчивых промастигот L. panamensis , показывающих значения IC 50 , аналогичные значениям, обнаруженным против L. дикого типа.panamensis (рис. 6С). Эдельфозин оказался наиболее эффективным ЩФ против SbV-устойчивых промастигот L. panamensis , и не наблюдалось разницы в чувствительности к эдельфозину между штаммами дикого типа и устойчивыми к SbV (фиг. 6С).
Заражение хомяков устойчивыми к SbV паразитами L. panamensis в носу показало, что ежедневное пероральное лечение эдельфозином (26 мг / кг массы тела) в течение 4 недель привело к резкому снижению индекса эволюции, паразитарной нагрузки и местное воспаление (рис. 6, Г – Е).Первые признаки улучшения были обнаружены примерно через две недели лечения (рис. 6А). Эти данные показывают, что пероральное лечение эделфозином было эффективным против лейшманиоза, вызванного устойчивыми к SbV паразитами L. panamensis .
Дифференциальное время, необходимое для формирования устойчивости к эдельфозину и милтефозину у
Leishmania spp. промастиготОсновной проблемой в антипаразитарной химиотерапии является формирование лекарственной устойчивости.Таким образом, затем мы проанализировали возможность создания лекарственной устойчивости к милтефозину и эдельфозину у различных видов Leishmania путем постепенного увеличения концентрации лекарственного средства. Мы определили время, необходимое для достижения устойчивости к 30 мкМ милтефозину или эдельфозину. Эта концентрация лекарственного средства может быть подходящей для различения специфических и неспецифических эффектов, и поэтому устойчивость к лекарственным средствам рассматривалась, когда паразиты становились устойчивыми к конечной концентрации лекарственного средства 30 мкМ. Мы обнаружили, что при непрерывном воздействии л.donovani , L. major и L. panamensis промастигот к увеличению количества милтефозина привело к довольно быстрому появлению лекарственной устойчивости после 40–64 дней лечения (таблица 2). Однако для выработки устойчивости к эдельфозину у промастигот L. major и L. panamensis потребовалось относительно более продолжительное непрерывное лечение (таблица 2). Интересно, что лечение милтефозином привело к появлению лекарственной устойчивости у L. donovani через относительно короткий период времени (таблица 2), а после 100-дневной обработки L. лекарственной устойчивости выявлено не было.donovani с эдельфозином (таблица 2).
Обсуждение
Наши результаты показывают антилейшманиальную активность in vitro и in vivo эдельфозина против различных видов Leishmania . Способность эдельфозина убивать отдельные Leishmania spp. промастигот и амастигот в целом выше, чем у других ЩФ, а по антилейшманиальной активности ЩФ оценивают эдельфозин> перифозин> милтефозин> эруцилфосфохолин. Эдельфозин также демонстрирует более высокую способность вызывать апоптозоподобную гибель клеток у Leishmania , чем милтефозин (Импавидо), который был одобрен как первый пероральный препарат, активный против висцерального лейшманиоза [2].Однако недавние исследования поставили под сомнение эффективность милтефозина в отношении некоторых видов кожного лейшманиоза [13] — [15], [17] — [20], и сообщалось о случаях рецидива паразитов, принимавших милтефозин, при висцеральном и диффузном кожном лейшманиозе [82]. — [84], а также у ВИЧ-положительных пациентов [85], [86].
Здесь мы обнаружили, что эдельфозин проявляет выдающуюся активность против большого числа Leishmania spp. вызывает кожный, слизисто-кожный и висцеральный лейшманиоз. Эдельфозин был способен убивать паразитов как в промастиготной, так и в амастиготной формах посредством апоптозного процесса, который включал деградацию ДНК, что оценивалось по увеличению процента клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. Leishmania паразиты инфицируют макрофаги, в которых они находятся и размножаются в компетентной вакуоли слияния (паразитофорная вакуоль). Интересно, что адельфозин эффективно убивал амастиготы внутриклеточных паразитов внутри макрофагов, не затрагивая клетки-хозяева. Эта убивающая активность в отношении внутриклеточных паразитов, по-видимому, в основном обусловлена прямым действием препарата на паразита, поскольку эдельфозин не мог индуцировать генерацию NO в макрофагах, в то время как флуоресцентный аналог эдельфозина накапливался у внутриклеточных паразитов внутри макрофагов.
Наши данные также показывают замечательную антилейшманиозную активность эдельфозина в нескольких анализах in vivo с использованием моделей мышей и хомяков, инфицированных L. major , L. panamensis или L. braziliensis . Насколько нам известно, это первое исследование с использованием хомяков в качестве животных моделей для оценки in vivo ЩФ против кожного лейшманиоза. Кроме того, свидетельства in vitro и in vivo показали, что эдельфозин очень эффективен против SbV-устойчивых паразитов Leishmania .Это важно, поскольку пятивалентные препараты сурьмы глюкантайм и пентостам используются для лечения лейшманиоза более шести десятилетий, и по-прежнему являются препаратами первой линии выбора и традиционным лечением во всем мире. Однако устойчивость к пятивалентной сурьме возникает в результате их широкого использования. Яркий пример устойчивости к SbV хорошо задокументирован в Бихаре (Индия), где находится примерно 90% случаев висцерального лейшманиоза в Индии, что составляет около 50% случаев в мире, и где устойчивость прекратила использование SbV более десяти лет назад [ 2].
Основным потенциальным недостатком использования милтефозина может быть относительно быстрое формирование лекарственной устойчивости in vitro . Мы обнаружили, что для формирования лекарственной устойчивости требуется более длительное время инкубации Leishmania spp. с эделфозином, чем с милтефозином. Кроме того, в то время как милтефозин вызывал лекарственную устойчивость у L. donovani после 40-дневного лечения, после 100-дневной инкубации устойчивости к эдельфозину не было обнаружено.
Следует отметить, что лечение милтефозином было неудовлетворительным в отношении инфекций, вызываемых L.braziliensis [13] — [15], [17] — [20], тогда как здесь мы обнаружили замечательную противопаразитарную активность эдельфозина у хомяков, инфицированных L. braziliensis . Кроме того, эдельфозин предлагает ряд дополнительных преимуществ по сравнению с милтефозином, например, тот факт, что эдельфозин проявляет сильное противовоспалительное действие [87] и не проявляет явной токсичности [87]. Leishmania паразиты проникают в первые нейтрофилы посредством регуляции процессов слияния гранул, что предотвращает любое вредное воздействие на паразита [88]. Leishmania паразиты используют полиморфноядерные нейтрофилы в качестве промежуточных хозяев перед их конечной доставкой к макрофагам после поглощения инфицированных паразитами нейтрофилов, и таким образом Leishmania может ускользнуть от иммунной системы хозяина [89]. Значительная часть разрушений, вызванных кожным лейшманиозом, происходит из-за сильного воспаления в месте инфекции на коже, приводящего к изъязвлению [90]. Нейтрофилы рекрутируются в очаг инфекции во время кожного лейшманиоза [91], [92], а накопление нейтрофилов связано с повреждением тканей [93].Эдельфозин вызывает выделение L-селектина (CD62L) и, таким образом, предотвращает экстравазацию нейтрофилов в очаг воспаления или инфекции [87]. На этом основании лейшманиоз можно облегчить пероральным лечением эдельфозином, которое могло бы снизить нагрузку на паразитов, путем прямого уничтожения паразитов, а также язвенного процесса и последующего образования рубцов за счет уменьшения рекрутирования нейтрофилов в очаг инфекции. .
Серьезным недостатком милтефозина является его тератогенное действие [24], однако до сих пор не проводилось исследований предполагаемого тератогенного действия эдельфозина.
Исследования, представленные здесь, предоставляют убедительные доказательства мощной антилейшманиальной активности эдельфозина, которая вместе с низким профилем токсичности, проявляемым этим эфирным липидом, и его противовоспалительной активностью, требует дальнейшей клинической оценки в качестве возможного альтернативного лечения лейшманиоза.
Благодарности
Мы признательны П. Кропфу и Б. Г. Сьерре за отличную и умелую помощь на начальных этапах этого исследования.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: FM REV JAV-P.Проведены эксперименты: REV JAV-P EY IM DLM JL-A. Проанализированы данные: REV JAV-P IM MM SMR CEM JL-A AM IDV FM. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: IM IDV FM. Написал статью: FM REV JAV-P.
Ссылки
- 1. ВОЗ (2010) Борьба с лейшманиозами. Издание World Health Organ Tech Rep Ser 949: 1–186.
- 2. Мюррей Х.В., Берман Д.Д., Дэвис С.Р., Саравиа Н.Г. (2005) Достижения в борьбе с лейшманиозом. Ланцет 366: 1561–1577.
- 3. Hotez PJ, Remme JH, Buss P, Alleyne G, Morel C и др.(2004) Борьба с тропическими инфекционными заболеваниями: отчет проекта «Приоритеты борьбы с болезнями в развивающихся странах». Clin Infect Dis 38: 871–878.
- 4. Алвар Дж., Апарисио П., Асеффа А., Ден Бур М., Канавате С. и др. (2008) Связь между лейшманиозом и СПИДом: вторые 10 лет. Clin Microbiol Rev 21: 334–359.
- 5. ван Гриенсвен Дж., Баласегарам М., Мехеус Ф., Алвар Дж., Линен Л. и др. (2010) Комбинированная терапия висцерального лейшманиоза.Lancet Infect Dis 10: 184–194.
- 6. Мишра Дж., Саксена А., Сингх С. (2007) Химиотерапия лейшманиоза: прошлое, настоящее и будущее. Curr Med Chem 14: 1153–1169.
- 7. Сундар С. (2001) Лекарственная устойчивость при индийском висцеральном лейшманиозе. Trop Med Int Health 6: 849–854.
- 8. Сундар С., Чаттерджи М. (2006) Висцеральный лейшманиоз — современные терапевтические методы. Индийский журнал J Med Res 123: 345–352.
- 9. Palumbo E (2010) Стратегии лечения кожно-слизистого лейшманиоза.J Glob Infect Dis 2: 147–150.
- 10. Croft SL, Sundar S, Fairlamb AH (2006) Лекарственная устойчивость при лейшманиозе. Clin Microbiol Rev 19: 111–126.
- 11. Santos DO, Coutinho CE, Madeira MF, Bottino CG, Vieira RT и др. (2008) Лечение лейшманиоза — проблема, которая не решена: обзор. Parasitol Res 103: 1–10.
- 12. Сундар С., Джа Т.К., Такур С.П., Энгель Дж., Зиндерманн Х. и др. (2002) Пероральный милтефозин при индийском висцеральном лейшманиозе.N Engl J Med 347: 1739–1746.
- 13. Сото Дж., Арана Б. А., Толедо Дж., Риццо Н., Вега Дж. К. и др. (2004) Милтефозин от кожного лейшманиоза нового мира. Clin Infect Dis 38: 1266–1272.
- 14. Велес И., Лопес Л., Санчес Х, Местра Л., Рохас С. и др. (2010) Эффективность милтефозина для лечения американского кожного лейшманиоза. Am J Trop Med Hyg 83: 351–356.
- 15. Machado PR, Ampuero J, Guimaraes LH, Villasboas L, Rocha AT и др.(2010) Милтефозин в лечении кожного лейшманиоза, вызванного Leishmania braziliensis в Бразилии: рандомизированное и контролируемое исследование. PLoS Negl Trop Dis 4: e912.
- 16. Chrusciak-Talhari A, Dietze R, Chrusciak Talhari C, da Silva RM, Gadelha Yamashita EP, et al. (2011) Рандомизированное контролируемое клиническое испытание для оценки эффективности и безопасности милтефозина при лечении кожного лейшманиоза, вызванного Leishmania ( Viannia ) guyanensis в Манаусе, Бразилия.Am J Trop Med Hyg 84: 255–260.
- 17. Сото Дж., Ри Дж., Вальдеррама М., Толедо Дж., Валда Л. и др. (2009) Эффективность пролонгированного (шесть недель) лечения лейшманиозом слизистых оболочек милтефозином в Боливии. Am J Trop Med Hyg 81: 387–389.
- 18. Сото Дж., Толедо Дж., Валда Л., Балдеррама М., Ри И. и др. (2007) Лечение лейшманиоза слизистой оболочки Боливии милтефозином. Clin Infect Dis 44: 350–356.
- 19. Сото Дж., Берман Дж. (2006) Лечение кожного лейшманиоза Нового Света с помощью милтефозина.Trans R Soc Trop Med Hyg 100: Дополнение 1S34–40.
- 20. Сото Дж., Сото П. (2006) Пероральный милтефозин для лечения лейшманиоза. Биомедика 26: Дополнение 1207–217.
- 21. Sundar S, Jha TK, Thakur CP, Bhattacharya SK, Rai M (2006) Пероральный милтефозин для лечения индийского висцерального лейшманиоза. Trans R Soc Trop Med Hyg 100: Дополнение 1S26–33.
- 22. Бхаттачарья С.К., Синха П.К., Сундар С., Тхакур С.П., Джа Т.К. и др. (2007) Фаза 4 испытания милтефозина для лечения индийского висцерального лейшманиоза.J Infect Dis 196: 591–598.
- 23. Рахман М., Ахмед Б.Н., Фаиз М.А., Чоудхури М.З., Islam QT и др. (2011) Фаза IV испытания милтефозина у взрослых и детей для лечения висцерального лейшманиоза (кала-азар) в Бангладеш. Am J Trop Med Hyg 85: 66–69.
- 24. Зиндерманн Х., Энгель Дж. (2006) Разработка милтефозина в качестве перорального средства для лечения лейшманиоза. Trans R Soc Trop Med Hyg 100: Дополнение 1S17–20.
- 25. Перес-Виктория Ф.Дж., Санчес-Канете М.П., Зейферт К., Крофт С.Л., Сундар С. и др.(2006) Механизмы экспериментальной устойчивости Leishmania к милтефозину: значение для клинического использования. Обновление «Устойчивость к наркотикам» 9: 26–39.
- 26. Зайферт К., Мату С., Хавьер Перес-Виктория Ф., Кастанис С., Гамарро Ф. и др. (2003) Характеристика промастигот Leishmania donovani , устойчивых к гексадецилфосфохолину (милтефозину). Int J Antimicrob Agents 22: 380–387.
- 27. Зейферт К., Перес-Виктория Ф.Дж., Стеттлер М., Санчес-Канете М.П., Кастанис С. и др.(2007) Инактивация переносчика милтефозина, LdMT, вызывает устойчивость к милтефозину, которая присуща стадии амастиготы Leishmania donovani и сохраняется in vivo . Int J Antimicrob Agents 30: 229–235.
- 28. Моллинедо Ф., Фернандес-Луна Дж. Л., Гайате С., Мартин-Мартин Б., Бенито А. и др. (1997) Селективная индукция апоптоза в раковых клетках эфирным липидом ET-18-OCH 3 (Edelfosine): требования к молекулярной структуре, клеточное поглощение и защита с помощью Bcl-2 и Bcl-X L .Cancer Res 57: 1320–1328.
- 29. Mollinedo F, de la Iglesia-Vicente J, Gajate C, Estella-Hermoso de Mendoza A, Villa-Pulgarin JA, et al. (2010) In vitro и in vivo селективная противоопухолевая активность Эдельфозина против лимфомы из клеток мантии и хронического лимфоцитарного лейкоза с участием липидных рафтов. Clin Cancer Res 16: 2046–2054.
- 30. Mollinedo F, de la Iglesia-Vicente J, Gajate C, Estella-Hermoso de Mendoza A, Villa-Pulgarin JA, et al.(2010) Таргетная терапия на липидные рафты при множественной миеломе. Онкоген 29: 3748–3757.
- 31. Gajate C, Mollinedo F (2002) Биологическая активность, механизмы действия и биомедицинские перспективы противоопухолевого эфирного фосфолипида ET-18-OCH 3 (Edelfosine), проапоптотического агента в опухолевых клетках. Curr Drug Metab 3: 491–525.
- 32. Gajate C, Mollinedo F (2001) Противоопухолевый эфирный липид ET-18-OCH 3 индуцирует апоптоз посредством транслокации и кэппирования Fas / CD95 в мембранные рафты в лейкемических клетках человека.Кровь 98: 3860–3863.
- 33. Gajate C, Mollinedo F (2007) Эдельфозин и перифозин вызывают селективный апоптоз при множественной миеломе путем привлечения рецепторов смерти и нижестоящих сигнальных молекул в липидные рафты. Кровь 109: 711–719.
- 34. Gajate C, Del Canto-Janez E, Acuna AU, Amat-Guerri F, Geijo E, et al. (2004) Внутриклеточный запуск агрегации Fas и рекрутирование апоптотических молекул в обогащенные Fas рафты при селективном апоптозе опухолевых клеток.J Exp Med 200: 353–365.
- 35. Croft SL, Snowdon D, Yardley V (1996) Активность четырех противораковых алкиллизофосфолипидов против Leishmania donovani , Trypanosoma cruzi и Trypanosoma brucei . J Antimicrob Chemother 38: 1041–1047.
- 36. Escobar P, Matu S, Marques C, Croft SL (2002) Чувствительность видов Leishmania к гексадецилфосфохолину (милтефозин), ET-18-OCH 3 (эдельфозин) и амфотерицину B.Acta Trop 81: 151–157.
- 37. Санта-Рита Р.М., Энрикес-Понс А., Барбоза Х.С., де Кастро С.Л. (2004) Эффект лизофосфолипидных аналогов эдельфозина, илмофозина и милтефозина против Leishmania amazonensis . J Antimicrob Chemother 54: 704–710.
- 38. Кабрера-Серра М.Г., Лоренцо-Моралес Дж., Ромеро М., Валладарес Б., Пинеро Дж. Э. (2007) Активность перифозина in vitro : новый алкилфосфолипид против стадии промастигот видов Leishmania .Parasitol Res 100: 1155–1157.
- 39. Cabrera-Serra MG, Valladares B, Pinero JE (2008) Активность перифозина in vivo против Leishmania amazonensis . Acta Trop 108: 20–25.
- 40. Verma NK, Dey CS (2004) Возможный механизм опосредованной милтефозином смерти Leishmania donovani . Антимикробные агенты Chemother 48: 3010–3015.
- 41. Paris C, Loiseau PM, Bories C, Breard J (2004) Милтефозин вызывает смерть, подобную апоптозу, у промастигот Leishmania donovani .Антимикробные агенты Chemother 48: 852–859.
- 42. Тейлор В.М., Муньос Д.Л., Седено Д.Л., Велес И.Д., Джонс М.А. и др. (2010) Leishmania tarentolae : полезность в качестве модели in vitro для скрининга антилейшманиозных агентов. Exp Parasitol 126: 471–475.
- 43. David-Cordonnier MH, Gajate C, Olmea O, Laine W., de la Iglesia-Vicente J, et al. (2005) ДНК-мишени и не-ДНК в механизме действия противоопухолевого препарата трабектин. Chem Biol 12: 1201–1210.
- 44. Гаджате С., Сантос-Бенеит А.М., Мачо А., Лазаро М., Эрнандес-Де Рохас А. и др. (2000) Участие митохондрий и каспазы-3 в апоптозе лейкозных клеток человека, индуцированном ET-18-OCH 3 . Int J Cancer 86: 208–218.
- 45. Gajate C, Barasoain I, Andreu JM, Mollinedo F (2000) Индукция апоптоза в лейкозных клетках с помощью обратимого агента, разрушающего микротрубочки 2-метокси-5- (2 ‘, 3′, 4’-триметоксифенил) -2,4, 6-циклогептатриен-1-он: защита с помощью Bcl-2 и Bcl-X L и остановка клеточного цикла.Cancer Res 60: 2651–2659.
- 46. Кесада Э., Дельгадо Дж., Гаджате С., Моллинедо Ф., Акуна А.Ю. и др. (2004) Флуоресцентные фенилполиеновые аналоги простого эфира фосфолипида эдельфозина для селективного мечения раковых клеток. J Med Chem 47: 5333–5335.
- 47. Моллинедо Ф., Фернандес М., Хорнильос В., Дельгадо Дж., Амат-Герри Ф. и др. (2011) Участие липидных рафтов в локализации и дисфункции противоопухолевого эфирного фосфолипида эдельфозина в митохондриях.Смерть клетки 2: e158.
- 48. Henao HH, Osorio Y, Saravia NG, Gomez A, Travi B (2004) Эффективность и токсичность пятивалентных сурьмы (Glucantime и Pentostam) на американской модели кожного лейшманиоза на животных: применение люминометрии. Биомедика 24: 393–402.
- 49. Эстелла-Эрмосо де Мендоса А., Кампанеро М.А., де ла Иглесиа-Висенте Дж., Гаджате С., Моллинедо Ф. и др. (2009) Противоопухолевый алкиловый эфир, липид эдельфозин: распределение в тканях и фармакокинетическое поведение у здоровых и несущих опухоль мышей с ослабленным иммунитетом.Clin Cancer Res 15: 858–864.
- 50. Gajate C, Matos-da-Silva M, Dakir E-H, Fonteriz RI, Alvarez, et al. (2012) Противоопухолевый аналог алкил-лизофосфолипида эдельфозин вызывает апоптоз при раке поджелудочной железы, воздействуя на эндоплазматический ретикулум. Онкоген. (Под давлением).
- 51. Гаджате С., Фонтериз Р.И., Кабанер С., Альварес-Новес Г., Альварес-Родригес И. и др. (2000) Внутриклеточный запуск Fas, независимо от FasL, как новый механизм апоптоза, индуцированного противоопухолевыми эфирными липидами.Int J Cancer 85: 674–682.
- 52. Nieto-Miguel T, Gajate C, Mollinedo F (2006) Дифференциальные мишени и субклеточная локализация противоопухолевого алкил-лизофосфолипида в лейкозных клетках по сравнению с клетками солидных опухолей. J Biol Chem 281: 14833–14840.
- 53. Gajate C, Gonzalez-Camacho F, Mollinedo F (2009) Участие агрегатов рафта, обогащенных сигнальным комплексом, вызывающим смерть Fas / CD95, в антилейкемическом действии эдельфозина в клетках Jurkat. PLoS ONE 4: e5044.
- 54. Саугар Дж. М., Дельгадо Дж., Хорнильос В., Луке-Ортега Дж. Р., Амат-Герри Ф. и др. (2007) Синтез и биологическая оценка флуоресцентных лейшманицидных аналогов гексадецилфосфохолина (милтефозина) как зондов антипаразитарных механизмов. J Med Chem 50: 5994-6003.
- 55. Mollinedo F, Martinez-Dalmau R, Modolell M (1993) Ранняя и селективная индукция апоптоза в лейкозных клетках человека с помощью алкил-лизофосфолипида ET-18-OCH 3 . Biochem Biophys Res Commun 192: 603–609.
- 56. Алонсо М.Т., Гаджате С., Моллинедо Ф., Модолелл М., Альварес Дж. И др. (1997) Диссоциация эффектов противоопухолевого эфирного липида ET-18-OCH 3 на цитозольный кальций и на апоптоз. Br J Pharmacol 121: 1364–1368.
- 57. Варела М.Р., Муньос Д.Л., Робледо С.М., Колли Б.К., Дутта С. и др. (2009) Leishmania ( Viannia ) panamensis : анализ in vitro с использованием экспрессии GFP для скрининга антилейшманиозных препаратов.Exp Parasitol 122: 134–139.
- 58. Колодзей Х., Кидерлен А.Ф. (2005) Антилейшманиальная активность и иммуномодулирующие эффекты танинов и родственных соединений на Leishmania , паразитирующих на клетках RAW 264.7. Фитохимия 66: 2056–2071.
- 59. Коласанти М., Градони Л., Матту М., Персичини Т., Сальвати Л. и др. (2002) Молекулярные основы антипаразитарного действия NO. Int J Mol Med 9: 131–134.
- 60. Ascenzi P, Bocedi A, Gradoni L (2003) Антипаразитарные эффекты оксида азота.IUBMB Life 55: 573–578.
- 61. Eue I, Zeisig R, Arndt D (1995) Алкилфосфохолин-индуцированное производство оксида азота и фактора некроза опухоли альфа клетками U937. J Cancer Res Clin Oncol 121: 350–356.
- 62. Kuhlencord A, Maniera T, Eibl H, Unger C (1992) Гексадецилфосфохолин: пероральное лечение висцерального лейшманиоза у мышей. Антимикробные агенты Chemother 36: 1630–1634.
- 63. Ле Фишу Y, Руссо Д., Ферруа Б., Рютт С., Лельевр А. и др.(1998) Краткосрочная и долгосрочная эффективность гексадецилфосфохолина против установленной инфекции Leishmania infantum у мышей BALB / c. Антимикробные агенты Chemother 42: 654–658.
- 64. Murray HW (2000) Подавление рецидива экспериментального висцерального лейшманиоза после лечения у мышей с дефицитом Т-клеток пероральным милтефозином. Антимикробные агенты Chemother 44: 3235–3236.
- 65. Серрано-Мартин X, Паярес Дж., Де Лукка М., Мартинес Дж. К., Мендоса-Леон А. и др.(2009) Амиодарон и милтефозин действуют синергетически против Leishmania mexicana и могут вызывать паразитологическое излечение на мышиной модели кожного лейшманиоза. Антимикробные агенты Chemother 53: 5108–5113.
- 66. Melby PC, Chandrasekar B, Zhao W, Coe JE (2001) Хомяк как модель висцерального лейшманиоза человека: прогрессирующее заболевание и нарушение выработки оксида азота на фоне выраженного Th2-подобного цитокинового ответа. J Immunol 166: 1912–1920.
- 67.Sacks DL, Melby PC (2001) Животные модели для анализа иммунных ответов на лейшманиоз. Curr Protoc Immunol Глава 19: Раздел 19 12.
- 68. Hommel M, Jaffe CL, Travi B, Milon G (1995) Экспериментальные модели лейшманиоза и тестирования антилейшманиозных вакцин. Ann Trop Med Parasitol 89: Suppl 155–73.
- 69. Osorio LE, Castillo CM, Ochoa MT (1998) Лейшманиоз слизистой оболочки, вызванный Leishmania ( Viannia ) panamensis в Колумбии: клинические характеристики.Am J Trop Med Hyg 59: 49–52.
- 70. Гонсалес Ю., Пинарт М., Ренгифо-Пардо М., Макая А., Альвар Дж. И др. (2009) Вмешательства при американском кожном и кожно-слизистом лейшманиозе. Кокрановская база данных Syst Rev CD004834.
- 71. Гупта Р., Кушаваха П.К., Самант М., Джайсвал А.К., Бахария Р.К. и др. (2012) Лечение хомяков, инфицированных Leishmania donovani , милтефозином: анализ экспрессии мРНК цитокинов с помощью ПЦР в реальном времени, лимфопролиферации, продукции нитритов и ответов антител.Журнал Antimicrob Chemother 67: 440–443.
- 72. Сундар С., Рай М. (2005) Лечение висцерального лейшманиоза. Экспертное мнение Pharmacother 6: 2821–2829.
- 73. Чакраварти Дж., Сундар С. (2010) Лекарственная устойчивость при лейшманиозе. J Glob Infect Dis 2: 167–176.
- 74. Ярдли В., Ортуно Н., Льянос-Куентас А., Чаппуис Ф., Донкер С.Д. и др. (2006) Американский тегументарный лейшманиоз: Связан ли результат лечения сурьмой с восприимчивостью к паразитарным препаратам? J Infect Dis 194: 1168–1175.
- 75. Аревало Дж., Рамирес Л., Адауи В., Зимич М., Туллиано Дж. И др. (2007) Влияние видов Leishmania ( Viannia ) на реакцию на лечение сурьмой у пациентов с американским тегументарным лейшманиозом. J Infect Dis 195: 1846–1851.
- 76. Эфрос М., Битнун А., Шакед П., Вальдман Е., Зильберштейн Д. (1999) Стадийная активность пятивалентной сурьмы против Leishmania donovani аксенических амастигот. Противомикробные агенты Chemother 43: 278–282.
- 77. Lucumi A, Robledo S, Gama V, Saravia NG (1998) Чувствительность Leishmania viannia panamensis к пятивалентной сурьме коррелирует с образованием расщепляемых комплексов ДНК-белок. Антимикробные агенты Chemother 42: 1990–1995.
- 78. Робледо С.М., Валенсия, Аризона, Саравия, Н.Г. (1999) Чувствительность к глюкантиму Leishmania viannia , выделенных от пациентов до лечения. J Parasitol 85: 360–366.
- 79. Walker J, Saravia NG (2004) Ингибирование Leishmania donovani промастиготной ДНК-топоизомеразы I и человеческих моноцитарных ДНК-топоизомераз I и II с помощью сурьмяных препаратов и классических антитопоизомеразных агентов.J Parasitol 90: 1155–1162.
- 80. Хадиги Р., Буше П., Хамесипур А., Миамар А.Р., Рой Дж. И др. (2007) Glucantime-устойчивые Leishmania tropica , изолированные от иранских пациентов с кожным лейшманиозом, чувствительны к альтернативным препаратам против лейшмании. Parasitol Res 101: 1319–1322.
- 81. Шокри А., Шарифи И., Хамесипур А., Нахаи Н., Фасихи Харанди М. и др. (2012) Влияние верапамила на чувствительность in vitro промастигот и амастигот стадий Leishmania tropica к меглуминовому сурьму.Parasitol Res 110: 1113–1117.
- 82. Pandey BD, Pandey K, Kaneko O, Yanagi T, Hirayama K (2009) Рецидив висцерального лейшманиоза после лечения милтефозином у пациента из Непала. Am J Trop Med Hyg 80: 580–582.
- 83. Calvopina M, Gomez EA, Sindermann H, Cooper PJ, Hashiguchi Y (2006) Рецидив диффузного кожного лейшманиоза нового мира, вызванный Leishmania ( Leishmania ) mexicana после лечения милтефозином.Am J Trop Med Hyg 75: 1074–1077.
- 84. Зерпа О., Ульрих М., Бланко Б., Полегре М., Авила А. и др. (2007) Диффузный кожный лейшманиоз поддается лечению милтефозином, но затем рецидивирует. Br J Dermatol 156: 1328–1335.
- 85. Troya J, Casquero A, Refoyo E, Fernandez-Guerrero ML, Gorgolas M (2008) Долгосрочная неэффективность милтефозина в лечении рефрактерного висцерального лейшманиоза у пациентов со СПИДом. Scand J Infect Dis 40: 78–80.
- 86. Sindermann H, Engel KR, Fischer C, Bommer W (2004) Пероральный милтефозин от лейшманиоза у пациентов с ослабленным иммунитетом: сочувственное использование у 39 пациентов с ВИЧ-инфекцией.Clin Infect Dis 39: 1520–1523.
- 87. Моллинедо Ф., Гайате С., Моралес А.И., дель Канто-Янез Э., Джастис Н. и др. (2009) Новое противовоспалительное действие без токсичности эдельфозина с защитным эффектом при экспериментальном колите. J Pharmacol Exp Ther 329: 439–449.
- 88. Mollinedo F, Janssen H, de la Iglesia-Vicente J, Villa-Pulgarin JA, Calafat J (2010) Селективное слияние азурофильных гранул с фагосомами, содержащими Leishmania , в нейтрофилах человека.J Biol Chem 285: 34528–34536.
- 89. ван Зандберген Г., Клингер М., Мюллер А., Данненберг С., Геберт А. и др. (2004) Передний край: нейтрофильные гранулоциты служат вектором для проникновения Leishmania в макрофаги. J Immunol 173: 6521–6525.
- 90. Tasew G, Nylen S, Lieke T, Lemu B, Meless H и др. (2010) Системная нейтрализация FasL и TRAIL снижает образование язв кожи, вызванных лейшманиозом. PLoS Negl Trop Dis 4: e844.
- 91.Bomfim G, Andrade BB, Santos S, Clarencio J, Barral-Netto M и др. (2007) Клеточный анализ кожной лейшманиозной лимфаденопатии: понимание ранних фаз заболевания человека. Am J Trop Med Hyg 77: 854–859.
- 92. Bretana A, Avila JL, Lizardo G, Convit J, Rondon AJ (1983) Leishmania видов: сравнительная ультраструктура экспериментальных узелков и диффузных кожных поражений человека при американских лейшманиозах. Exp Parasitol 55: 377–385.
- 93.Лопес Костка С., Дингес С., Гриванк К., Ивакура Ю., Удей М.С. и др. (2009) IL-17 способствует прогрессированию кожного лейшманиоза у восприимчивых мышей. J Immunol 182: 3039–3046.
Неорганические вещества | Бесплатный полнотекстовый | Синтез и противопаразитарная активность новых конъюгатов — органических препаратов, связанных с динуклеарными комплексами рутений (II) с тритиолатным мостиком — арен
1. Введение
В последние два десятилетия важные исследования в области борьбы с раком были сосредоточены на использовании соединений рутения в качестве альтернативы препаратам платины, которые в настоящее время используются в качестве терапевтических средств [1,2,3,4].Среди выдающихся соединений, открывших путь для недавних исследований в этой области, остаются комплексы рутения (III) NKP-1339 (транс- [тетрахлоридобис (1H-индазол) рутенат (III)] натрия) [5,6,7] и NAMI-A (имидазолий [транс- [тетрахлорид (S-диметилсульфоксид) — (1H-имидазол) рутенат (III)]) [6,8], а также комплексы рутений (II) -арен RAPTA-C ([Ru (II) (η 6 -p-MeC 6 H 4 Pr i ) Cl 2 (PTA)], PTA = 1,3,5-триаза-7-фосфоадамантан ) [9,10,11] и RM175 ([Ru (II) (η 6 -бифенил) Cl (en)] PF 6 , en = 1,2-этилендиамин) [7,12,13 ].Металлоорганический каркас рутений (II) -арен оказался универсальной платформой для разработки новых биоорганических металлов и катионных или нейтральных соединений с общей структурой [(η 6 -арен) Ru (X) (Y) (Z) ], обладающие как гидрофобными, так и гидрофильными свойствами, привлекают все большее внимание [14]. Вслед за работой, начатой RAPTA-C и RM175 , исследования металлоорганических комплексов рутений (II) с ареном не только быстро развиваются, но и особенно актуальны, с множеством соединений, обладающих противораковыми, антибиотическими, противогрибковыми и противопаразитарными свойствами [ 15,16,17,18,19,20].Важные исследования были сосредоточены на гибридных структурах, в которых прочное рутениевое (II) -ареновое звено связано с различными биологически активными соединениями, стратегия, имеющая значение для разработки новых соединений на основе металлов, представляющих множество мишеней [21]. Биядерный рутений с тритиолатным мостиком. Комплексы (II) –арен составляют особую группу соединений рутений (II) –арен, структура которых основана на двух полусэндвич-звеньях, связанных тремя тиолами, образующими тригонально-бипирамидальное звено (рис. 1).Можно выделить два типа структур, а именно симметричные комплексы (рис. 1, A и A ‘), в которых три тиола идентичны (общая формула [(η 6 -p-MeC 6 H 4 Pr i ) 2 Ru 2 (μ 2 -SR) 3 ] X) и смешанные комплексы (Рисунок 1, B ), содержащие хотя бы один другой тиол (общая формула [( η 6 -p-MeC 6 H 4 Pr i ) 2 Ru 2 (μ 2 -SR1) 2 (μ 2 -SR2)] X).Эти соединения первоначально были разработаны и оценены как катализаторы [22], а затем как цитотоксические агенты. В частности, комплекс A ’ (R = Bu t ) был высокоактивен против раковых клеток, культивируемых in vitro [23,24,25,26,27], и три аналога также были протестированы in vivo [28,29]. Это побудило нас оценить комплексы тритиолатодирутения как потенциальные противопаразитарные средства, а некоторые производные оказались высокоактивными против Toxoplasma gondii [30], Neospora caninum [31] и Trypanosona brucei [32].Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC 50 ) комплексов A (R = Me), A ‘ (R = Bu t ) и B против тахизоитов T. gondii, культивируемых in vitro, составили 34 , 62 и 1 нМ соответственно, и эти соединения не нарушали жизнеспособность фибробластов крайней плоти человека (HFF) клеток-хозяев [30]. Токсоплазмоз считается одним из наиболее распространенных паразитарных заболеваний, поражающих примерно одну треть населения мира. У иммунокомпетентных хозяев инфекция обычно контролируется и протекает бессимптомно, но у лиц с ослабленным иммунитетом, таких как пациенты со СПИДом или лица, проходящие иммуносупрессивную терапию, вновь приобретенный реактивированный токсоплазмоз может вызвать серьезные осложнения, такие как токсоплазматический энцефалит или токсоплазмоз глаз [33], а также первичное инфицирование во время лечения. беременность, может привести к абортам или порокам развития плода.Существующие терапевтические варианты являются субоптимальными, нацелены только на острое заболевание и не искореняют паразитов в инцистированных организмах хронических инфекций (брадизоитах) [34,35]. Кроме того, часто сообщается о побочных эффектах [34,36]. Таким образом, необходимы более безопасные и эффективные варианты лечения. Катионные тритиолато-биядерные комплексы рутений (II) –арен представляют собой многообещающие каркасы. Привязка функциональной молекулы (например, флуорофора, метаболита, лекарства) к металлическому каркасу является одной из стратегий, используемых для отслеживания, направления или модуляции биологической активности комплексов на основе металлов [37,38,39].Во многих случаях конъюгация с металлоорганическими частями приводила к усилению биологической активности исходного лекарственного средства [4,40]. Соединения тритиолатодирутения показали высокую стабильность, и пост-функционализация мостиковых тиолов оказалась полезным методом для внесения ценных модификаций [41,42,43]. Этот подход осуществляется в мягких условиях и представляет собой эффективный вход для конъюгатов с биорелевантными фрагментами. Легкий доступ и масштабирование некоторых смешанных соединений тритиолатдирутения, содержащих дериватизируемые группы (например,g., OH, SH, NH 2 , CO 2 H) [27,43] (как B , рисунок 1) позволили разработать и исследовать гибридные структуры, функционализированные противораковым препаратом хлорамбуцилом [41], Флуорофоры 7-амино-кумарина [43] и пептиды [42]. Этот тип структуры направлен на повышение цитотоксичности в отношении раковых клеток [41,42], растворимости в воде [42], а также селективности и противопаразитарной активности в отношении T. gondii [43]. В этом исследовании был использован ряд антимикробных агентов различного строения. проявляющие также соответствующую антитоксоплазменную активность, были выбраны для конъюгирования с ядром тритиолатодирутения (рис. 1) [34,36,44,45].Рутений (II) -арен, а также иридий (III) — и родий (III) -циклопентадиенил являются одними из предпочтительных металлоорганических единиц, которые следует тестировать во внутримолекулярной комбинации с различными лекарствами. Сульфонамиды (сульфамидные препараты), такие как сульфадиазин (4- амино-N- (пиримидин-2-ил) бензолсульфонамид), сульфаметоксазол (4-амино-N- (5-метилизоксазол-3-ил) бензолсульфонамид) и сульфадоксин (4-амино-N- (5,6-диметоксипиримидин- 4-ил) бензолсульфонамид (рис. 1) представляют собой бактериостатические агенты, обладающие широким спектром действия против грамположительных и грамотрицательных бактерий, токсоплазмы и других патогенов простейших.Комбинации лекарств, включая пириметамин / сульфадиазин и триметоприм / сульфаметоксазол, остаются одними из наиболее часто применяемых методов лечения токсоплазмоза [34,36,46,47,48]. Несколько исследований были сосредоточены на сочетании сульфамидных препаратов с различными металлоорганическими единицами полусэндвича «пианино-стул» для биологических применений [49,50,51] (например, C и D на рисунке 2). Сульфамид может быть непосредственно скоординирован с металлоорганической единицей ( C ) [49] или может быть ковалентно связан с лигандом ( D ) [50,51].«Фортепианный стул» полусэндвич-соединения типа [(η 6 -p-MeC 6 H 4 Pr i ) Ru (сульфадиазин) 2 ] и [(η 5 — C 5 Me 5 ) Rh (сульфадиазин) 2 ] (где C 5 Me 5 представляет собой пентаметилциклопентадиенил) ( C , фигура 2) оценивали на их потенциальную антимикробную активность [49]. В то время как комплекс рутения был биологически неактивным, соединение родия было сильным против грамположительных бактерий, Candida albicans и Cryptococcus neoformans [49].Другим примером является серия рутениевых, родиевых и иридиевых производных сульфадоксина, закрепленных на N, N’-хелатных пиридилиминохинолилимино-бидентатных лигандах [50] (например, D , рис. 2). Скрининг in vitro активности против штаммов Plasmodium falciparum, чувствительных и устойчивых к хлорохину, и Mycobacterium tuberculosis показал, что активность зависит от металлоорганических единиц, при этом комплексы рутения неактивны. Соединения родия и иридия подавляли рост паразитов со значениями IC 50 в суб- и низком микромолярном диапазоне без значительной токсичности по отношению к эмбриональным клеткам почек человека (HEK293).Более того, сульфадоксин не проявлял активности в большинстве анализов, что подтверждает гипотезу о том, что металлоорганические конъюгаты лекарственных средств могут благотворно влиять на биоактивность. Триклозан (5-хлор-2- (2,4-дихлорфенокси) фенол, рис. 1) является антибактериальным средством, которое было показано, что он ингибирует пролиферацию тахизоитов T. gondii in vitro в низком наномолярном диапазоне [52,53]. Поскольку триклозан имеет плохую растворимость в воде и биодоступность при пероральном приеме, различные исследования были сосредоточены на производных, направленных на повышение растворимости и эффективности [54,55,56], а также на улучшение доставки лекарств и фармакологические свойства против T.gondii [57,58,59]. Метронидазол (1-β-гидроксиэтил-2-метил-5-нитроимидазол, рис. 1) используется для лечения антибактериальных и противопротозойных инфекций [60,61]. Значительное уменьшение кист головного мозга наблюдалось в модели хронического токсоплазмоза у мышей после комбинированного лечения спирамицином и метронидазолом [62]. Была проведена оценка потенциального использования комплекса рутений (II) -бензолметронидазол E в качестве цитотоксического агента для гипоксических клеток, что выявило более высокую селективную токсичность для E по сравнению со свободным метронидазолом [63].Фторхинолоновые антибиотики (такие как ципрофлоксацин (1-циклопропил-6-фтор-4-оксо-7- (пиперазин-1-ил) -1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота) широко используются у человека и Ветеринария. Наряду с другими фторхинолонами в предыдущих сообщениях были выявлены многообещающие антитоксоплазменные эффекты при лечении некоторыми производными ципрофлоксацина [64,65]. Комплексы рутений (II) -арен, содержащие лиганды на основе фторхинолонов, показали интересную противораковую и противомикробную активность (например, F и G на Рисунке 2) [66,67,68].Лекарство может быть либо непосредственно скоординировано с металлом ( F ), либо ковалентно связано с лигандом ( G ). Координирующее звено 7- (4- (деканоил) пиперазин-1-ил) -ципрофлоксацина с рутением (II) (η 6 -p-MeC 6 H 4 Pr i ) в соединении F [67] показал многофункциональные свойства: высокую цитотоксичность в отношении нескольких линий раковых клеток и умеренную дозозависимую антибактериальную активность в отношении Escherichia coli, а также клинического изолята E. coli, устойчивого к β-лактамам.Соединение G , содержащее ципрофлоксацин, связанный с аминометил (дифенил) фосфиновым лигандом, было загружено в полимерные наноформы и обнаружило многообещающую цитотоксичность in vitro [66]. Производные, содержащие фрагмент 1,4-нафтохинона, включая атоваквон (2 — ((1r) , 4r) -4- (4-хлорфенил) циклогексил) -3-гидроксинафталин-1,4-дион, рис. 1), бупарваквон (2 — ((4- (трет-бутил) циклогексил) метил) -3-гидроксинафталин- 1,4-дион) или лапахол (2-гидрокси-3- (3-метилбут-2-ен-1-ил) нафталин-1,4-дион) проявляют интересные противораковые и противопаразитарные свойства [69,70,71,72 , 73].Атоваквон (рис. 1) активен in vitro против тахизоитов T. gondii с низкими наномолярными значениями IC 50 и является одним из препаратов, применяемых в настоящее время для лечения острого токсоплазмоза у людей [34,36,48]. Бупарваквон также очень активен против T. gondii in vitro и, как было показано, ограничивает церебральную инфекцию маток и вертикальную передачу у мышей, инфицированных ооцистами T. gondii [70]. Комплексы рутений (II) –арен с лигандами на основе нафтохинона показали потенциальные противораковые свойства [74,75,76,77,78] (например,g., H и I на Рисунке 2). Рутений (II) –p-MeC 6 H 4 Комплекс Pr i H с лапахолом в качестве бидентатного лиганда, как было показано, индуцирует апоптоз раковых клеток человека в низком микромолярном диапазоне за счет механизма действия, включающего окислительную стресс [77]. Связанный с гидразоном конъюгат плюмбагина рутения (II) I показал отчетливое и избирательное ингибирование роста раковых клеток, более сильное связывание с ДНК, чем плюмбагин, и ингибирование транспортера Pgp (P-гликопротеина) [74].Это исследование было направлено на синтез новых конъюгированных антимикробных препаратов, конъюгированных с биядерным рутением (II) с тритиолатным мостиком и ареновой единицей. Библиотека активных органических соединений включала сульфамидные препараты (дапсон, сульфаметоксазол, сульфадиазин, сульфадоксин), триклозан, метронидазол, ципрофлоксацин и менадион (2-метилнафталин-1,4-дион) (рис. 1). Помимо природы противомикробного лекарственного средства, для гибридных молекул были исследованы различные структурные вариации, такие как связующее звено между двумя компонентами (сложный эфир, амид, триазол) и относительная пропорция единицы лекарственного средства / дирутениевого фрагмента (т.е.е., 1: 1 против 3: 1).Противомикробные препараты, вновь полученные конъюгаты и ассоциированные промежуточные соединения были подвергнуты первому скринингу in vitro для оценки активности против трансгенного штамма T. gondii, конститутивно экспрессирующего β-галактозидазу (T. gondii β-gal), выращенного в фибробластах крайней плоти человека. (HFF). Параллельно с этим оценивали цитотоксичность этих соединений на неинфицированных HFF с помощью анализа alamarBlue. Соединения, проявляющие интересную противопаразитарную активность и низкую цитотоксичность, были подвергнуты T.gondii IC 50 определение.
Лабораторно подтвержденные случаи висцерального лейшманиоза с устойчивостью к милтефозину из Индии | Паразиты и переносчики
История болезни
Два пациента с подозрением на лекарственно-устойчивую ВЛ были направлены в нашу лабораторию для подтверждения диагноза в первые 6 месяцев 2011 года. Оба пациента были из эндемичных по ВЛ территорий. Первым пациентом (LD843) был 12-летний мальчик, уроженец района Патна в Бихаре (рис. 1), но проживавший в Дели (неэндемичный район ВЛ) более 5 лет, хотя он часто возвращался в родную деревню в Бихаре.Направленный в марте 2011 года из детской больницы Калавати Саран, Нью-Дели, у пациента в течение последних 20 дней началась сильная лихорадка, которая не поддавалась лечению жаропонижающими средствами и антибиотиками широкого спектра действия (принимаемыми на месте). При клиническом и лабораторном обследовании у него была обнаружена умеренная гепато-спленомегалия и тяжелая анемия с уровнем гемоглобина 5,2 г / дл [нормальный диапазон (NR) 12–14 г / дл]. Пациент ранее посещал свою родную деревню в Бихаре в ноябре 2010 года.
Рис. 1Карта Индии с выделенными VL эндемичными штатами Бихар и Джаркханд ( красный ). На карте также показаны места, из которых в этом исследовании были зарегистрированы два случая ВЛ, устойчивых к милтефозину
Второй пациент (LD860), 37-летний мужчина из района Деогарх в Джаркханде (рис. 1), был направлен в апреле 2011 года. Этот человек обратился в местную больницу в Джаркханде в ноябре 2009 года с жалобами на потерю. аппетита и массы тела.У LD860 в анамнезе постоянная лихорадка в течение более двух недель, резистентная к жаропонижающим средствам и антибиотикам. При клиническом обследовании пациент имел анемию, лихорадку, умеренную гепато-спленомегалию, пальпировали печень и селезенку 142 и 152 мм соответственно. У него было количество лейкоцитов 10 600 мм 3 (NR 4 000–10 000 мм 3 ), гемоглобин 8,6 г / дл (NR 12–14 г / дл), с 50% нейтрофилов (NR 40–70%). ) и 44% лимфоцитов (NR 20–35%). После положительного результата теста на альдегид сыворотки на ВН в январе 2010 г. вводили САГ в дозе 20 мг / кг / день в течение 21 дня.В течение 5 дней его общее состояние улучшилось, у пациента поднялась температура. Однако через 6 месяцев (август 2010 г.) его клинические симптомы вернулись. В этот момент у него была тяжелая анемия с уровнем гемоглобина 5,2 г / дл, количеством лейкоцитов 8 800 мм 3 , с 63% нейтрофилов и 34% лимфоцитов. Аспираты костного мозга показали большое количество телец Лейшмана-Донована (LD). На этот раз пациенту вводили амфотерицин В в дозе 1,0 мг / кг / день в течение 15 дней. Однако лечение было прервано из-за плохой переносимости.Клинические и лабораторные признаки ВЛ сохранялись, и его повторный костный мозг оставался положительным на тельца LD. Ферменты печени пациента были значительно увеличены: значение SGPT составляло 92 МЕ / л (NR 0–41 МЕ / л), а билирубин сыворотки — 2,6 мг / дл (NR 0,2–1,0 мг / дл). Однако после прекращения лечения амфотерицином B его гемоглобин увеличился до нормальных пределов, то есть 11,7 г / дл. В сентябре 2010 г. пациенту назначили милтефозин в дозе 50 мг / 2 раза в сутки в течение 28 дней. Несмотря на то, что у пациента поднялась температура в течение недели и результаты лабораторных исследований были удовлетворительными, уровень ферментов печени и билирубина оставался высоким, в связи с чем ему давали пищевые добавки и лечили симптоматически.В феврале 2011 г. пациент снова обратился с жалобами на повышение температуры тела, желтуху и тяжесть в правом подреберье. Лабораторные исследования выявили повышение ферментов печени [SGOT] и обратное соотношение альбумин-глобулин. Ультрасонография брюшной полости показала легкую гепатомегалию и умеренную спленомегалию. Наконец, 8 апреля 2011 года местный врач направил пациента во Всеиндийский институт медицинских наук в Нью-Дели для дальнейшего обследования и лечения.
Оба пациента прошли тщательное лабораторное обследование во Всеиндийском институте медицинских наук, Нью-Дели.Отбор проб проводился экспертом-флеботомистом в центральном сборнике института и отправлялся нам для обычных исследований, в том числе на лейшманиоз. Образцы сыворотки пациента были протестированы с помощью тест-полоски анти-rK39 (экспресс-тест kala-azar Detect ™, In Bios International, Inc., Сиэтл, Вашингтон, США) и точечного теста анти-rKE16 (Signal ® -KA и Crystal ® KA, Arkray Healthcare Private Limited [ранее Span Diagnostics Limited], Сурат, Гуджарат, Индия. Последние тесты основаны на новом рекомбинантном антигене [26], полученном из индийского штамма (KE16) L.donovani (MHOM / IN / 1998 / KE16). Оба являются коммерчески доступными экспресс-тестами и одобрены правительством Индии для подтверждения диагноза лейшманиоза. Тестирование потока через пятно Signal ® -KA, тест на щуп для измерения бокового потока Crystal ® KA (rKE16) и экспресс-тест kala-azar Detect ™ (rK39) [27] дали положительные результаты. Этиологический агент заболевания был дополнительно подтвержден микроскопическим исследованием телец LD в мазках, приготовленных из лейкоцитарной пленки крови. Образцы лейкоцитарной пленки крови обоих пациентов использовали для выделения паразита на среде Novy-MacNeal-Nicolle (NNN).
Культура паразитов
Для приготовления среды NNN 1,4 г агара и 0,6 г NaCl суспендировали в 90 мл дистиллированной воды, которую затем автоклавировали при 121 ° C в течение 20 мин. Раствор охлаждали до 50 ° C перед добавлением 10 мл дефибринированной крови кролика. Затем аликвотировали два с половиной мл смеси в пробирки Bijou на 7 мл, давали остыть и затвердевать при комнатной температуре и, наконец, хранили при 4 ° C. Одну аликвоту использовали для контроля качества. Непосредственно перед инокуляцией образца 2 мл среды M199 с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и раствора антибиотика, содержащего 50 мкг / мл гентамицина (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури, США) и добавляли 100 мкг / мл соли сульфата стрептомицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). После этого образцы лейкоцитарной пленки (дважды промытые 1 × PBS) инокулировали в среду NNN и переносили в инкубатор биохимической потребности в кислороде (BOD) для инкубации при 25 ° C. Загрязнение грибами проверяли через 4 дня и повторяли каждые 4 дня, чтобы контролировать рост Leishmania spp. до 30-го дня инокуляции. Затем каждые семь дней культуру пассировали в свежую среду NNN.Затем паразитов постепенно адаптировали к среде M-199 с добавлением 10% FBS, гентамицина и стрептомицина (полная среда) для массовой культуры. Каждый изолят был типизирован до уровня вида с использованием данных последовательности из внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) ДНК после ПЦР (см. Ниже). Затем изоляты были охарактеризованы на предмет их лекарственной чувствительности. Паразитов проверяли на их чувствительность in vitro к стандартным антилейшманиозным препаратам в течение десяти пассажей после изоляции. Оба изолята были подвергнуты нуклеотидному секвенированию и анализу SNP гена LdMT и LdRos с использованием программного обеспечения Torrent v5.0.1, как описано ниже.
Генетическая характеристика видов
Паразитарная ДНК из обоих клинических образцов подвергалась ПЦР-амплификации для Leishmania- специфичных ITS-областей. Вкратце, общую геномную ДНК выделяли из лейкоцитарной пленки крови с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Полную ITS-область рибосомы (~ 1,1 т.п.н.) затем амплифицировали с использованием Leishmania -специфических праймеров (прямой 5′-CTG GAT CAT TTT CCG ATG-3 ‘; и обратный 5’-ACA CTC AGG TCT GTA AAC-3 ‘) [28].Амплификацию выполняли в термоциклере (Eppendorf, Гамбург, Германия) и сначала нагревали до 95 ° C в течение 2 минут, затем следовали 34 цикла при 95 ° C в течение 20 секунд, 53 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты. . Окончательное удлинение проводили при 72 ° C в течение 1 мин. ПЦР-ампликон вырезали для очистки с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen, Hilden, Германия) из 1,8% агарозного геля, приготовленного в 1 × буфере TAE. Очищенный ПЦР-ампликон затем секвенировали с использованием ABI Prism Big Dye Terminator v1.1 набор для циклического секвенирования (Applied Biosystems, Калифорния, США).
Тест на лекарственную чувствительность in vitro (анализ МТТ)
Жизнеспособность промастигот изолятов (LD843 и LD860) по сравнению со стандартным штаммом DD8 (обычно поддерживаемого и пассированного in vivo у сирийского хомяка для поддержания вирулентности и инфекционности) [29]. определяется по 3 стандартным препаратам с помощью теста МТТ [30]. Клетки (1 × 10 4 клеток / 100 мкл / лунка) инкубировали в 96-луночном планшете с плоским дном (Nunc, Roskilde, Дания), используя различные концентрации Sb III , активного компонента SAG [4], амфотерицина. B и милтефозин в течение 48 ч при 26 ° C.Лекарства были получены от Sigma-Aldrich (Sb III ), Lifecare Innovations Gurgaon, Харьяна, Индия (Амфотерицин B), и Zentaris Frankfurt, Германия (Милтефозин). Вкратце, исходные растворы всех трех препаратов растворяли в стерильной дистиллированной воде. Каждый был дополнительно серийно разбавлен до семи раз свежеприготовленной полной средой и инкубирован, как описано выше, в течение 48 часов при 26 ° C в инкубаторе BOD. После 48 ч инкубации в каждую лунку добавляли 25 мкл стерильного МТТ (5 мг / мл, растворенного в 1 × PBS) и планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C.После инкубации в каждую лунку добавляли 150 мкл чистого диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы остановить реакцию. Оптическую плотность измеряли на считывающем устройстве для микропланшетов при длине волны 570 нм. Ингибирующий эффект конкретного лекарственного средства выражали как 50% -ную ингибирующую концентрацию (IC 50 ), то есть концентрацию лекарственного средства, которая требуется для 50% -ного ингибирования жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками в культуральной среде без лекарств. IC 50 рассчитывали из графика, показывающего различные концентрации стандартных лекарственных средств в зависимости от процента роста клеток.Каждый тест проводился в двух экземплярах с тремя независимыми экспериментами.
Антиамастиготный анализ
Клеточную линию макрофагов мыши J-774A.1 использовали для оценки активности милтефозина против внутриклеточных амастигот, трансформированных из клинических изолятов. Затем его сравнивали со стандартным штаммом DD8 ВОЗ, который является обще-чувствительным штаммом, выделенным в 1968 году. Исследования амастигот против SAG и амфотерицина B не проводились, поскольку стадия промастигот клинических изолятов была чувствительна к этим препаратам.Клетки высевали на предметные стекла камеры для культивирования тканей с 16 лунками при плотности 4 × 10 4 клеток / мл в среде RPMI 1640 с 10% FBS. Срезы инкубировали при 37 ° C с 5% CO 2 . Через 24 ч среду заменяли средой, содержащей метациклические промастиготы при соотношении макрофагов / паразитов 1:10. Это соотношение позволяет промастиготам поглощаться макрофагами и превращаться в амастиготы за 24 часа. После 24 ч инкубации при 37 ° C с 5% CO 2, одно предметное стекло фиксировали в 100% метаноле и окрашивали с использованием Giemsa для определения начального уровня инфекции.После достижения удовлетворительного уровня инфекции слайды подвергали воздействию милтефозина в дозах 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,12 мкМ (в двух экземплярах) и инкубировали в течение 48 часов при 37 ° C и 5% CO 2 . После инкубации предметные стекла окрашивали Гимза и исследовали под микроскопом. Бремя паразитов рассчитывали как [процент инфицированных макрофагов × (среднее количество амастигот / макрофаг)] и сравнивали с бременем паразитов в необработанных инфицированных контрольных клетках. Большинство макрофагов разрушались при более высоких концентрациях милтефозина (> 25 мкМ) и не могли быть оценены.Результаты рассчитывали как процент подавления общей нагрузки паразитов, и IC 50 рассчитывали из графика, показывающего различные концентрации милтефозина в зависимости от процентного ингибирования. Эти тесты были выполнены в двух экземплярах с тремя независимыми повторами.
Секвенирование всего генома, сборка и анализ SNP LD843
Для анализа генома полную геномную ДНК (гДНК) экстрагировали из штамма LD843 с использованием набора для экстракции геномной ДНК Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия).Целостность и чистоту гДНК анализировали на 0,8% агарозном геле, приготовленном в 1 × TAE. Полногеномное секвенирование штамма LD843 проводили с использованием считывания парных концов 2 × 400 п.н. с использованием персональной геномной машины Ion Torrent (PGM, Thermofisher, MA, США) и чипа для секвенирования 316v2 (Thermofisher, MA, США). Последовательности низкого качества и последователи были удалены из чтения на основе оценки качества phred (Q-30) отдельных баз. Чтения были собраны в более длинные каркасы с помощью сборки SPAdes v3.1 [31]. Неправильно называемые одиночные основания и вставки / делеции (инделки) в собранных контигах были исправлены с помощью программного обеспечения Iterative Correction of Reference Nucleotides (iCORN) [32]. Анализ качества последовательности и глубины чтения был проведен с использованием программного обеспечения Torrent extension analysis v4.2 [33]. Средство просмотра интегративной геномики (IGV) [34] использовалось для визуализации отдельных считываний для анализа качества считывания и отображения контигов.
Чтения без сопоставления и реплик были удалены из собранных операций чтения на основании более низких показателей качества сопоставления BQ (<30).Анализ секвенирования для LD860 в настоящее время находится в процессе.
АнализSNP гена (ов), участвующего в устойчивости к милтефозину.
Анализ SNPбыл проведен после выравнивания эталонных последовательностей для последовательностей генов LdMT и LdRos с выровненной de novo последовательностью LD843 с использованием программного обеспечения Torrent option caller. v5.0.1 [35] Области, которые имели глубину считывания менее 100-кратного покрытия и максимум три полиморфизма в любых заданных семи основных областях, были выбраны в качестве возможных вариабельных сайтов, в то время как INDEL были идентифицированы с помощью Variant caller v5.1 программное обеспечение. Принятое покрытие считыванием вариантов оснований было> 3 для прямой и обратной цепей и> 6 для качества SNP и минимум одно удаленное считывание из промежутка контига. Показатели CIGAR отображают качество сопоставления и SNP для всех операций чтения на определенном сайте. Для гетерозиготных SNP была проверена оценка варианта BQ или CIGAR, чтобы убедиться, что она не была значительно хуже, чем у эталонного генотипа BQ. Чтобы уменьшить ошибку секвенирования, был принят ряд шагов по проверке качества SNP, включая обнаружение SNP низкого качества.Положение отдельных SNP визуализировали с помощью программного обеспечения IGV для анализа глубины чтения, качества фильтрации и оценки гаплотипов [34].
Статистический анализ
Данные представлены как среднее значение и стандартное отклонение (± SD) трех независимых экспериментов. Процент жизнеспособности клеток и значения IC 50 рассчитывали с использованием Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corp, Вашингтон, США).
Шутки Джимми Киммеля непривитым нельзя попадать в койку в отделении интенсивной терапии
Джимми Киммел Джеймс (Джимми) Кристиан Киммел Ночное здравоохранение — Представлено Национальным советом по психическому благополучию — комиссия FDA рекомендует ревакцинальную вакцину Moderna для людей с высоким риском Леди Гага, Лин-Мануэль Миранда, Джулия Луи-Дрейфус среди звезд, призывающих руководителей индустрии развлечений поддержать меры по борьбе с изменением климата Фокс Гутфельд издевается над ночными хозяевами для запланированной «климатической ночи» БОЛЬШЕ предложил во время своего монолога во вторник вечером, что людям, не вакцинированным против COVID-19, следует дать более низкую приоритет для коек в отделениях интенсивной терапии.
В его первую ночь после многомесячного отпуска «Jimmy Kimmel Live!» ведущий прокомментировал рост числа случаев коронавируса по всей стране по мере распространения дельта-варианта.
«С точки зрения COVID это не был веселый уик-энд Дня труда», — сказал Киммел в своем постпраздничном монологе. «Доктор Фаучи сказал, что, если больницы станут еще более переполненными, им придется сделать очень трудный выбор, кому достанется койка в отделении интенсивной терапии».
Он добавил: «Этот выбор мне не кажется таким сложным.« Привитый человек с сердечным приступом? Да, приходите, мы позаботимся о вас.Невакцинированный парень, который сожрал конскую слизь? Покойся с миром, хрипы ».
Комментарий Киммела« конская слизь », кажется, ссылается на животный противопаразитарный препарат ивермектин, который некоторые используют для борьбы с COVID-19, несмотря на предупреждения Федерального управления по лекарственным средствам (FDA).
« Вы не лошадь. Вы не корова. Серьезно, вы все. Остановите это », — написало в Твиттере FDA вместе с заявлением, призывающим людей прекратить употребление этого препарата.
Киммел назвал людей, которые отказываются пройти вакцинацию или обращаются к лекарствам, не одобренным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, для лечения вируса, как« пан-тупиц ».«
Я даю вам все… Джимми Киммел pic.twitter.com/aYFtvkUYVH
— Defiant L’s (@DefiantLs) 8 сентября 2021 г.
« Люди все еще принимают этот ивермектин. В токсикологический центр резко возросло количество звонков от людей, принимающих это лекарство для домашнего скота для борьбы с коронавирусом, но они не принимают вакцину. Это как если бы вы веган и говорили: «Нет, я не хочу гамбургер, дайте мне вместо этого банку Альпо», — пошутил Киммел.
The Seattle Times сообщила во вторник, что Вашингтонский токсикологический центр получил в три раза больше звонков, связанных с ивермектином, чем в прошлом году, поскольку люди продолжают экспериментировать с этим препаратом.
Среди самых громких сторонников этого препарата — популярный подкастер Джо Роган, который объявил, что принимает ивермектин вместе с множеством других препаратов после заражения вирусом 1 сентября.
Комментарии Киммела вызвали критику со стороны тех, кто чувствовал себя шутки хозяина были дурным вкусом, в том числе сенатор Тед Круз, Рафаэль (Тед) Эдвард Круз Ночное здравоохранение — Представлено Carequest — Смерть Колина Пауэлла подчеркивает риски для ослабленного иммунитета Процесс утверждения сенатом нарушен — демократы Сената могут исправить это Австралийский политик на Крузе, вакцины : «Нам не нужны твои лекции, спасибо, дружище» БОЛЬШЕ (R-Техас).
«Мне сделали прививку, но я не желаю смерти тем, кто делает другой выбор», — написал сенатор в Твиттере после комментариев Киммела.
Больной. Злой левый всем, кто не согласен с ним по поводу вакцин:
«Покойся с миром, хрип».
ЭТО АКТУАЛЬНАЯ ЦИТАТА.
Мне сделали прививку, но я не желаю смерти тем, кто делает другой выбор. # BeBetter https://t.co/vXORAM0mhB
— Тед Круз (@tedcruz) 8 сентября 2021 г.
(PDF) Ингибиторы роста Leishmania donovani от Pathogen Box Compounds of Medicine for Malaria Venture
27.Эстевес М.А., Фрагиадаки И., Лопес Р., Скулика Е., Круз МЕМ.
Синтез и биологическая оценка аналогов трифуралина в качестве антиль-
эйшманиальных агентов. Bioorganic Med Chem., 2010; 18 (1): 274–281.
DOI: 10.1016 / j.bmc.2009.10.059
28. Берри С.Л., Хамид Х., Томасон А. и др. Разработка
NanoLuc-PEST, экспрессирующего Leishmania mexicana, в качестве нового инструмента для обнаружения лекарств. PLoS
Negl Trop Dis.2018; 12 (7): 1–20. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0006639
29. Нгуре П.К., Тонуи В.К., Ингонга Дж. и др. Антилейшманическое действие in vitro
активность экстрактов Warburgia ugandensis (Canellaceae),
кенийского лекарственного растения. Журнал Med Plant Res. 2009; 3 (2): 61–66.
30. ИТМА. Тест на милтефозин. Внутриклеточные амастиготы L. Donovani
КАЛАДРУГ-Р: Лабораторная СОП № 8.2010: 6–9.
31. Chou T.C., Мартин Н. CompuSyn для комбинаций лекарств и для
Руководство пользователя общего анализа эффекта дозы; 2007.Доступно по телефону:
www.combosyn.com. По состоянию на 18 марта 2020 г.
32. Даффи С., Сайкс М.Л., Джонс А.Дж. и др. Скрининг лекарств на предмет
коробки патогенных микроорганизмов малярии по множеству патогенов реклассифицирует
отправных точек для открытия лекарств с открытым исходным кодом. Антимикробные агенты
Chemother.2017; 61 (9): 1–22. DOI: 10.1128 / AAC.00379-17
33. Попов В.М., Чан DCM, Филлингем Ю.А., Йи В.А., Райт Д.Л.,
Андерсон А.С. Анализ комплексов ингибиторов с
Cryptosporidium hominis DHFR приводит к новому производному триметоприма
.Bioorg Med Chem Lett, 2006; 16: 4366–4370. DOI: 10.1016 /
j.bmcl.2006.05.047
34. Гебауэр М.Г., Маккинлей С., Греди Дж. Э. Синтез кватернизованных
2-аминопиримидо [4, 5-d] пиримидин-4 (3 H) — онов и их биологическая активность с дигидрофолатредуктазой. Eur J Med Chem 2003; 38.
doi: 10.1016 / S0223-5234 (03) 00140-5
35. Planer JD, Hulverson MA, Arif JA, Ranade RM, Don R, Buckner FS.
Тестирование синергии одобренных FDA лекарств выявляет сильнодействующие лекарственные препараты.
бинации против трипаносомы cruzi.PLoS Negl Trop Dis, 2014; 8: 7.
doi: 10.1371 / journal.pntd.0002977
36. Zhang C, Ondeyka JG, Herath KB, et al. Сильнозамещенные нилы terphe-
как ингибиторы паразитарной активности цГМФ-зависимой протеинкиназы.
J Nat Prod.2006; 6 (4): 710–712. DOI: 10.1021 / np0505418
37. Башка Ф., Сабадкай И., Хорват З. и др. Низкомолекулярные ингибиторы НАДФН-оксидазы
4. J. Med.2010; 53: 6758–6762. DOI: 10,1021 /
jm1004368
38.Паттерсон С., Уилли С., Норвал С. и др. Противотуберкулезный препарат
деламанид как потенциальное пероральное средство для лечения висцерального лейшманиоза.
Elife, 2016; 5 (e09744): 1–21. DOI: 10.7554 / eLife.09744
39. Сасахара К., Симокава Ю., Хирао Ю. и др. Фармакокинетика
и метаболизм деламанида, нового противотуберкулезного препарата, у животных
и человека: важность метаболизма альбумина in vivo. Drug Metab
Dispos. 2015; 43 (8): 1267–1276. DOI: 10.1124 / дмд.115.064527
40. Комитет по лекарственным средствам для человека (CHMP).
Отчет об оценке Деламанида (Дельтыба) EMA / CHMP / 125521/
2013. Vol. 44. London E14 4HB ●; 2014
41. Линч Дж., Шумовски Дж. Профиль деламанида для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью
. Лекарство Де Девель Тер, 2015; 677.
DOI: 10.2147 / DDDT.S60923
42. Кацуно К., Берроуз Дж. Н., Дункан К. и др. Критерии попадания и лидерства в открытии препарата
для инфекционных болезней развивающихся стран.Nat Rev
Drug Discov AOP.2015; 1–8. DOI: 10.1038 / nrd4683
43. MMV. Дополнительная информация Pathogen Box. Доступно по адресу: https: //
www.mmv.org/mmv-open/pathogen-box/pathogen-box-supporting-
информация. По состоянию на 17 июля 2019 г.
44. Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ. Экспериментальный
и вычислительные подходы для оценки растворимости и проницаемости
в условиях открытия и разработки лекарств. Adv Drug Deliv Rev.
2001; 46: 3–26. DOI: 10.1016 / S0169-409X (00) 00129-0
45. Слоан Д., Льюис Дж. Роль деламанида в лечении лекарственно-устойчивого туберкулеза
. Управление рисками в клинике, 2015; 779.
doi: 10.2147 / TCRM.S71076
46. Райан Н.Дж., Хан Дж. Деламанид: Первое глобальное одобрение (ОТЧЕТ ПО НИОКР INSIGHT
). Швейцария; 2014.
47. Ксавье А., Лакшманан М. Деламанид: новая броня в борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом
. J Pharmacol Pharmacother.2014; 5
(3): 222. DOI: 10.4103 / 0976-500X.136121
48. Малликаарджун С., Уэллс С., Петерсен С. и др. Деламанид
, вводимый одновременно с антиретровирусными или противотуберкулезными препаратами, не обнаруживает клинически значимых межлекарственных взаимодействий
у здоровых субъектов. Antimicrob
Agents Chemother. 2016; 60 (10): 5976–5985. DOI: 10.1128 /
AAC.00509-16.Address
49. Gurumurthy M, Mukherjee T, Dowd CS, et al. Специфичность субстрата
, деазафлавин-зависимая нитроредуктаза (Ddn) из Mycobacterium
tuberculosis, ответственная за биоредуктивную активацию бициклических нитроимидазолов
.ФЕБ Журнал 2013; 279 (1): 113–125. DOI: 10.1111 / j.1742-
4658.2011.08404.x. Подложка
50. Паттерсон С., Уилли С., Стояновски Л. и др. R-энантиомер противотуберкулезного препарата
PA-824 в качестве потенциального перорального средства для лечения висцерального лейшманиоза
. Антимикробные агенты Chemother.2013; 57
(10): 4699–4706. DOI: 10.1128 / AAC.00722-13
51. Kamchonwongpaisan S, Quarrell R, Charoensetakul N, et al.
Ингибиторы множественных мутантов плазмодия falciparum dihydrofo-
поздней редуктазы и их противомалярийная активность.J Med Chem. 2004; 47
(3): 673–680. doi: 10.1021 / jm030165t
Дизайн, разработка и терапия лекарств Dovepress
Публикуйте свою работу в этом журнале
«Дизайн, разработка и терапия лекарств» — это международный журнал с открытым доступом, рецензируемый коллегами, который охватывает весь спектр разработки лекарств.
и разработка до клинических приложений. Клинические результаты,
безопасность пациентов, а также программы по разработке и эффективному, безопасному,
и устойчивому использованию лекарств являются особенностями журнала, который также был принят для индексации в PubMed Central.Система управления рукописью
полностью интерактивна и включает в себя очень быструю
и справедливую систему рецензирования, которая проста в использовании.