Антигельминтные средства в эндемичных по гельминтам районах: влияние на ВИЧ-инфекцию

Этот Кокрейновский обзор обобщил данные клинических испытаний, в которых оценивали пользу и потенциальные риски предоставления лекарств для дегельминтизации (антигельминтных или противоглистных средств) людям, инфицированным вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). После проведения поиска соответствующих клинических испытаний (по 29 сентября 2015 года) мы включили восемь клинических испытаний, включавших 1612 участников.

Что такое лекарства для дегельминтизации, и почему они могут задержать прогрессирование ВИЧ-инфекции

Лекарства для дегельминтизации используют для лечения различных глистных инвазий/инфекций у человека, например, гельминтов, передаваемых через почву, шистосомоза, онхоцеркоза и лимфатического филяриоза. В районах, где эти инфекции широко распространены, Всемирная организация здравоохранения рекомендует стандартное регулярное лечение целевых групп населения каждые 6-12 месяцев без предварительного индивидуального подтверждения инфекции. Эмпирическая терапия или лечение всех групп населения с предполагаемым риском инфекции является более предпочтительной стратегией, чем использование стратегии «тестируй и лечи», т. к. лекарства для дегельминтизации недорогие и хорошо переносятся. Кроме того, стратегия тестирования до начала лечения считается менее затратно-эффективной, учитывая, что доступные диагностические тесты являются относительно дорогими и могут демонстрировать слабую чувствительность.

Известно, что гельминтозы влияют на иммунную систему человека. Некоторые исследования говорят о том, что у людей с ВИЧ-инфекцией гельминтозы могут уменьшить число клеток CD4+ (которые являются критической частью иммунного ответа при ВИЧ-инфекции) и поставить под угрозу способность человека контролировать вирусную репликацию ВИЧ. Таким образом, лечение гельминтозов у людей с ВИЧ-инфекцией может быть особенно полезным, помимо той пользы, которую наблюдают у населения, в целом, в результате проведения дегельминтизации.

Какие доказательства представлены в этом обзоре

Лечение антигельминтными средствами всех ВИЧ-позитивных взрослых без предварительного знания о наличии у них гельминтной инвазии/инфекции может иметь небольшой супрессивный [подавляющий] эффект на вирусную нагрузку через шесть недель после лечения ( низкое качество доказательств ), но применение повторных доз в течение двух лет, как оказалось, имеет очень малый эффект, либо не имеет эффекта в отношении вирусной нагрузки (

среднее качество доказательств ) или числа клеток CD4+ ( низкое качество доказательств ). Эти выводы основаны на двух включенных исследованиях.

Предоставление лекарств для дегельминтизации ВИЧ-позитивным взрослым с диагностированной гельминтной инвазией/инфекцией может привести к небольшому подавляющему эффекту в отношении средней вирусной нагрузки в период от 6 до 12 недель после лечения ( низкое качество доказательств ) и небольшому благоприятному эффекту в отношении среднего числа CD4+ клеток через 12 недель после лечения ( низкое качество доказательств ). Однако, эти выводы основаны на небольших по размеру исследованиях и в значительной степени зависят от одного исследования празиквантела при шистосомозе. Необходимы дальнейшие исследования, проведенные в различных условиях и у разных групп населения.

Неблагоприятные события не были хорошо представлены ( очень низкое качество доказательств), и клинические испытания были слишком малыми по размеру, чтобы оценить влияние на смертность ( низкое качество доказательств ). Однако нет предположений, что лекарства для дегельминтизации являются вредными для ВИЧ-позитивных людей .

ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫЕ АНТИГЕЛЬМИНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В РЯДУ БЕНЗИМИДАЗОЛОВ: СИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ | Халиков

1. Спиридонов И.А. Мировая экономика. М.: Инфра-М, 2010. 272 с.

2. Соколов Э.М., Панарин В.М., Зуйкова А.А. Современные проблемы науки в области защиты окружающей среды. Тула: Изд-во ТулГУ, 2010. 400 с.

3. Успенский А.В. Актуальные проблемы ветеринарной паразитологии // Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва, 2004, вып. 5, C. 212-214.

4. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение. М.: Изд-во РАСХН, 2009. 109 с.

5. De Jong W.I., Born P.I.A. Drug delivery and nanoparticles: Applications and hazards. Inter. J. Nanomedicine, 2008, vol. 3, no. 2, pp. 133-149.

6. Халиков С.С., Халиков М.С., Метелева Е.С., Гуськов С.А., Евсеенко В.И., Душкин А.В., Буранбаев В.С., Фазлаев Р.Г., Галимова В.З., Галиуллина А.М. Механохимическая модификация свойств антигельминтных препаратов // Химия в интересах устойчивого развития. 2011. Т. 19, N6. C. 699-703.

7. Душкин А.В., Сунцова Л.П., Халиков С.С. Механохимическая технология для повышения растворимости лекарственных веществ // Фундаментальные исследования. 2013. N1-2. С. 448-457.

8. De Jong W.I., Born P.I.A. Drug delivery and nanoparticles: Applications and hazards. Inter. J. Nanomedicine, 2008, vol. 3, no. 2, pp. 133-149.

9. Лебедева М.Н., Коваленко Ф.П., Джабарова В.И. Экспериментальное обоснование пригодности медапека в качестве препарата выбора для лечения эхинококкозов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2004, N1, С. 40-44.

10. Астафьев Б.А., Яроцкий Л.С., Лебедева М.Н. Экспериментальные модели паразитов в биологии и медицине. М.: Наука, 1989. С. 67-73.

11. Кротов А.И. Основы экспериментальной терапии гельминтозов. М.: Медицинa, 1973. 272 с.

12. Pozio E. Trichinellosis in the European Union: ecology and economic impact // Parasitol. Today. 1998, vol. 14, no. 1, pp. 35-38.

Антигельминтные средства — это… Что такое Антигельминтные средства?

Антигельминтные средства

1. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг. 2. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — М.: Советская энциклопедия. — 1982—1984 гг.

• Антигельми́нтики
• Антигемофи́льный фа́ктор

Смотреть что такое «Антигельминтные средства» в других словарях:

• антигельминтные средства — см. Противоглистные средства …   Большой медицинский словарь

• Противоглистные средства — I Противоглистные средства (antihelminthica, синоним антигельминтные средства) химиотерапевтические средства для лечения заболеваний, вызываемых паразитическими червями и их личинками. В современной медицинской практике в качестве П. с.… …   Медицинская энциклопедия

• противоглистные средства — (antihelminthica; син.: антигельминтики, антигельминтные средства) лекарственные средства, применяемые для лечения глистных инвазий человека и животных (пиперазин, экстракт мужского папоротника, хлоксил и др.) …   Большой медицинский словарь

• АНТГЕЛЬМИНТНЫЕ СРЕДСТВА — (Anthelminthica), антигельминтные средства, антгельминтики, лекарственные вещества, применяемые с лечебной и профилактической целью при гельминтозах. А. с. обычно оказывают действие в отношении определённых групп гельминтов и реже —… …   Ветеринарный энциклопедический словарь

• МКБ-10: Класс XX —   Международная классификация болезней 10 го пересмотра (МКБ 10) Класс I Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II Новообразования Класс III Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный ме …   Википедия

• МКБ-10: Код Y — Международная классификация болезней 10 го пересмотра (МКБ 10) Класс I Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II Новообразования Класс III Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм Класс …   Википедия

• Альбендазол — …   Википедия

• Сурамин — Сурамин, suramin sodium; антипротозойное, антигельминтное средство Показания Сонная болезнь, вызванная Trypanosoma gambiense и Trypanosoma rhodesiense; онхоцеркоз. Сурамин лекарственное вещество (неметалл), представляет собой сложное производное… …   Википедия

• Трихиуриаз (Trichuriasis) — инвазия толстой кишки власоглавом вида Trichuris trichiura; заболевание распространено в основном в регионах с влажным тропическим климатом. Заражение человека происходит при употреблении им пищи, зараженной яйцами этих нематод. Основными… …   Медицинские термины

• ТРИХИУРИАЗ — (trichuriasis) инвазия толстой кишки власоглавом вида Trichuris trichiura; заболевание распространено в основном в регионах с влажным тропическим климатом. Заражение человека происходит при употреблении им пищи, зараженной яйцами этих нематод.… …   Толковый словарь по медицине

• НЕМАТОЦИДЫ — (нематициды), хим. средства для уничтожения растительноядных нематод вредителей с. х. культур. Иногда Н. наз. также антигельминтные ср ва, эффективные против нематодных паразитов животных. Св вами Н. обладают почвенные фумиганты, среди к рых… …   Химическая энциклопедия

Антигельминтики

СТАЙЛАБ предлагает стандарты и смеси антигельминтиков для их анализа в пищевом сырье и продукции хроматографическими методами в соответствии с ГОСТ 32834-2014, МУК № 539/5.3 и МУК А-1/044.

Антигельминтики, или антгельминтики – это название лекарственных средств, используемых для борьбы с гельминтами. Гельминты, или глисты – это черви, паразитирующие в кишечнике или в иных внутренних органах и тканях животных. Паразиты встречаются среди круглых червей – нематод. Среди плоских червей к паразитизму приспособлены цестоды (ленточные черви) и трематоды (сосальщики). Все они вызывают заболевания, от легких, как, например, энтеробиоз – поражение острицами, до очень тяжелых – таких, как поражение ленточными червями, трихинеллой или эхинококком.

Гельминтозы влияют на работу иммунной системы человека и животных: возникают воспалительные реакции, с которыми организм вынужден бороться. Предполагается, что гельминтозы повышают восприимчивость организма к инфекционным заболеваниям. При кишечных гельминтозах нарушается всасывание питательных веществ, что приводит к авитаминозам. У детей и молодых животных это может вызывать задержку физического и умственного развития, у взрослых – анемию, снижение аппетита и массы тела.

При гельминтозах органов и тканей, например, печени, легких, глаз, мышц, симптомы зависят от локализации, вида и количества паразитов. Обычно они приводят к нарушениям функционирования и повреждениям органа, воспалительным процессам, повышению температуры. Некоторые паразиты, например, трихинеллы, способны вызывать разрушение нейронов, что приводит к неврологическим нарушениям. Цисты эхинококка могут присутствовать в печени, легких, костях, мышцах, головном мозге. Цикл жизни аскариды включает не только кишечник, но и печень, сердце и легкие.

Гельминтозы значительно снижают качество жизни человека и наносят ущерб сельскому хозяйству. Некоторые из них легко передаются от особи к особи, другие предполагают попадание в организм личинок или яиц паразитов с пищей или водой. Нематода, вызывающая бругиоз – слоновую болезнь, или элефантиаз – проникает в организм с укусом комара. В 2018 году, по сообщениям СМИ, укус комара в Подмосковье привел к заражению дирофиляриозом человека.

В качестве антигельминтиков применяют различные классы веществ. Некоторые антигельминтики, например, тиабендазол и аверсектин C, используют и в качестве пестицидов: они токсичны не только для червей, но и для членистоногих. Другие, такие, как клорсулон, эффективны только против определенных гельминтов.

Механизмы действия антигельминтиков различаются. Бензимидазолы нарушают углеводный обмен паразитов, препятствуют работе некоторых ферментов и делению клеток, что приводит к гибели как взрослых червей, так к задержке развития их яиц и личинок. Ивермектины – химические производные авермектинов – нарушают передачу импульса от нейронов к мышцам, что вызывает у гельминтов паралич. Подобным же образом действуют пиперазины и бисалиниды. Парализованные гельминты выводятся естественным путем. В некоторых случаях в такие лекарственные средства добавляют слабительные. Хлорированные углеводороды и нарушают углеводный обмен гельминтов, и угнетают работу нервной системы. Салициланиды, к которым относится клозантел и фенасал (никлозамид), нарушают энергетические процессы в митохондриях клеток паразитов. Помимо этих классов антигельминтной активностью обладают некоторые органофосфаты, соединения мышьяка и другие вещества. Отдельно следует упомянуть препараты, разрушающие покровы гельминтов, например, празиквантел. Гельминт, лишившись защитных покровов, восприимчив к действию пищеварительных ферментов.

Выбор антигельминтика зависит от того, предназначен он для медицинских целей или для ветеринарного использования, а также от вида паразита и от его локализации. Очевидно, что антигельминтные средства, плохо всасывающиеся в кишечнике, удобны для уничтожения кишечных паразитов, но неэффективны против гельминтов, локализованных в мышцах. Некоторые гельминты способны вырабатывать устойчивость к определенным препаратам, в особенности, к бензимидазолам. В таких случаях обычно меняют препарат или увеличивают его дозу. Чтобы предотвратить возникновение резистентности к антигельминтикам, иногда используют лекарственные средства, содержащие несколько действующих веществ с разным механизмом действия. Такие препараты эффективны, даже если гельминты устойчивы к одному из его компонентов.

Многие антигельминтные средства способны в тех или иных количествах проникать в ткани организма и выделяться с молоком. Это означает, что они могут попадать в пищевое сырье и продукцию животного происхождения. Некоторые антигельминтики могут вызывать отравления человека и животных. Обычно они проявляются тошнотой, рвотой, болью в животе, однако, возможны и более тяжелые случаи. Поэтому необходимо контролировать содержание антигельминтных препаратов в пищевом сырье и продукции.

В Российской Федерации действует ГОСТ 32834-2014 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антгельминтиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором». Он подробно описывает методику анализа антигельминтных средств в пищевом сырье и содержит требования к материалам, в том числе, к стандартам антигельментиков. СТАЙЛАБ предлагает чистые вещества, изотопно-меченные формы, стандартные растворы и смеси антигельминтных препаратов. Производители сертифицированных стандартов аккредитованы в соответствии со стандартом ISO 17034:2016. К сертифицированным стандартам прилагаются сертификаты.

92. Антигельминтные средства.

По основной локализации гельминтов в организме человека различают ки­шечные и внекишечные гельминтозы, в качестве возбудителей которых могут быть круглые червы (нематоды), плоские черви, к которым относятся ленточ­ные черви (цестоды) и сосальщики (трематоды).

Т.о., механизму действия противоглистные средства подразделяют на ряд групп:

1) клеточные яды — четыреххлористый этилен;

2) средства, нарушающие функцию нервно-мышечной системы у круглых червей, — пирантела памоат, пиперазин и его соли, дитразин, левамизол, наф-тамон;

3) средства, парализующие нервно-мышечную систему преимуществен­но у плоских червей и разрушающие их покровные ткани, — фенасал, битио-нол;

4) средства, действующие преимущественно на энергетические процес­сы гельминтов, — аминоакрихин, пирвиния памоат, левамизол, мебендазол.

При нематодозе кишечника — аскаридозе — препаратами выбора явля­ются мебендазол, пирантела памоат, левамизол.

Производное имидазола мебендазол оказывает угнетающий эффект в отношении большинства круглых гельминтов (особенно активен при трихоце-фалезе, аскаридозе и энтеробиозе). Угнетает утилизацию гельминтами глюко­зы и парализует их. Оказывает губительное действие на яйца власоглава, аска­рид и анкилостом. Тем не менее, в больших дозах может быть использован для лечения внекишечных гельминто­зов — трихинеллеза и эхинококкоза. Быстро метаболизируется в печени.

Значительный интерес представляет бензимидазольное производное альбендазол. Обладает широким спектром антигельминтного дейст­вия. Эффективен при лечении кишечных нематодозов, а также при эхинококкозе и цистицеркозе. Блокирует захват гельминтами глюкозы, что приводит к их параличу и гибели. Оказывает губительное действие и на яйца аскарид, анки­лостом и власоглава. При длительном приеме (при лечении эхинококкоза курс длится 3 месяца) могут быть более выраженные и серьезные осложнения (лейкопения, абдоминальные боли, алопеция, рвота, кожные высыпания).

При инвазии круглыми гельминтами с успехом используется и пиран­тела памоат. Он нарушает нервно-мышечную передачу, угнетает холинэстеразу и вызывает у гельминтов спастический паралич. Наиболее часто применяется при аскаридозе, энтеробиозе и анкилостомидозе. Переносится хорошо. Побочные эффекты наблюдаются редко и выражены в небольшой степени (снижение аппетита, головные боли, тош­нота, понос).

Высокой эффективностью при аскаридозе обладает левамизол. Дегельминтизация обусловлена тем, что препарат парализует гельмин­тов. Связано это с деполяризацией их мышц. Кроме того, левамизол угнетает фумарат-редуктазу и таким путем нарушает метаболизм гельминтов. Одно­кратное введение левамизола приводит к дегельминтизации у 90 — 100% паци­ентов независимо от степени их инфицирования. Специальной диеты и приме­нения слабительных не требуется. В применяемых дозах левамизол практически не вызывает побочных эффектов.

При аскаридозе и энтеробиозе достаточно широко применяют пиперазин и его соли (адипинат, гексагидрат). Чаще всего используют пиперазина адипинат. На нематод пиперазин оказывает парализующее действие. По­следнее препятствует активному продвижению их по кишечнику, а также про­никновению в желчные ходы. Кроме того, при этом создаются благоприятные условия для выведения гельминтов из кишечника. Выделяются они в живом состоянии. Всасывается пиперазин из кишечника хорошо. Препарат и продук­ты его превращения выделяются преимущественно почками.

Активным препаратом этой группы является также моночетвертичное ам­мониевое соединение нафтамон (бефения гидроксинафтоат, алкопар). У гельминтов он вызывает контрактуру мышц, которая сменяется параличом. Из желуд очно-кишечного тракта всасывается плохо. Применяют нафтамон в основном при лечении анкилостомидоза и аскаридоза. При аскаридозе менее эффективен, чем левамизол и пиперазин. Соблюдение диеты при использова­нии нафтамона не требуется. Препарат обладает легким послабляющим эф­фектом, в связи с чем в назначении слабительных нет необходимости.

При кишечных цестодозах нашли применение празиквантель, фенасал, аминоакрихин.

Широким спектром антигельминтного действия обладает празикван­тель. Он высокоэффективен при кишечных цестодозах, а также при внекишечных трематодозах и цистицеркозе. По химическому строению может быть отнесен к производным пиразиноизохинолина. Наруша­ет обмен кальция у гельминтов, что приводит к нарушению функции мышц и параличу.

Фенасал угнетает окислительное фосфорилирование у цестод и парализует их. Кроме того, он снижает устойчивость ленточных гель­минтов к протеолитическим ферментам пищеварительного тракта, которые разрушают цестоды. В связи с этим препарат не рекомендуется применять при тениозе, возбудителем которого является вооруженный (свиной) цепень, так как при этом может возникнуть цистицеркоз¹.

Для терапии кишечного трематодоза (метагонимоза) применяют четы­реххлористый этилен (перхлорэтилен). Кроме того, этот препарат эф­фективен при анкилостомидозе. Из кишечника всасывается в небольшой сте­пени. В период подготовки и проведения дегельминтизации и 1 — 2 дня спустя дают пищу, богатую углеводами (без жиров; противопоказаны алкогольные на­питки). После приема препарата через 15-30 мин принимают солевое слаби­тельное.

Из внекишечных нематодозов наиболее распространенными являются разные филяриатозы.

К препаратам, губительно действующим на микрофилярии, относится дитразина цитрат. Он хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта. Максимальная концентрация его в плазме крови накапливается через 3 ч. Выделяется почками в виде метаболи­тов и частично в неизмененном виде в течение первых 2 сут. Применяют внутрь при ряде филяриатозов разной локализации. Побочные эффекты (головные боли, слабость, тошнота, рвота) довольно часты, но быстро проходят. Возможно, что часть из них связана с разрушением филярий и дейст­вием продуктов их распада.

Внекишечные трематодозы основным средством лечения шистосомозов является празиквантель. Он эффективен и при других внекишечных трематодозах. При шистосомозах приме­няют также препарат сурьмы — антимонилнатрия тартрат (винносурьмянонатриевая соль). Вводят его внутривенно (медленно). Препарат ток­сичен и часто вызывает побочные эффекты. Наиболее серьезны нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы, стойкая рвота, артриты, анафилакти­ческая реакция. Антимонил-натрия тартрат противопоказан при заболеваниях печени, недостаточности сердца, беременности. При отравлении препаратом в качестве его антагониста используют унитиол.

Мебендазол, албендазол, пирантел, пиперазин, левамизол, празиквантель, никлозамид.

МЕБЕНДАЗОЛ (Меbendazolum). 5-Бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол.

Синонимы: Вермокс, Аntioх, Меbensole, Меbutar, Меdosil, Multielmin, Neсаmin, Nemasole, Оvitelmin, Раntelmin, Pluriverm, Sirben, Теlmin, Vеrmirax, Vеrmох, Vertex, Vormin и др.

Мебендазол является высокоэффективным противоглистным средством. Действует на различные виды гельминтов, но наиболее эффективен при энтеробиозе и трихоцефалезе. Может также применяться при аскаридозе, анкилостомидозе, тениидозе и смешанных инвазиях.

Препарат избирательно поражает цитоплазматические микротубулы гельминтов, угнетает усвоение гельминтами глюкозы и тормозит образование в их организме АТФ.

Препарат плохо всасывается в кишечнике и почти полностью выделяется с калом (лишь в незначительных количествах с мочой).

Назначают мебендазол внутрь. Предварительного голодания, специальной диеты и применения слабительного не требуется.

При энтеробиозе взрослые и подростки принимают однократно.

При заражении другими гельминтами или при смешанных инвазиях назначают по 0, 1 г 2 раза в день в течение 3 дней. При тениидозе и стронгилоидозе взрослым дают по 0, 1 г 2 — 3 раза в день, детям — по 0, 1 г 2 раза в день в течение 3 дней.

При применении мебендазола могут наблюдаться аллергические реакции.

Препарат противопоказан при беременности.

ПИРАНТЕЛ (Руrantel). 1, 4, 5, 6-Тетрагидро-1-метил-2-[транс-2-(2-тиенил)-винил]-пиримидин.

Синонимы: Комбантрин, Немоцид, Аguipiran, Вifantrel, Соbantril, Соmbantrin, Неlmex, Меdintel, Nеmocid, Раmех, Раmintel, Раmotrin, Реlmintrel, Руrantel еmbonate, Strongid Р, Тrilombrin и др.

Выпускается в виде памоата (3-окси-2-нафтоата) или эмбоната .

Отечественное название эмбоната пирантеля — эмбовин.

Эффективен при энтеробиозе, аскаридозе, анкилостомидозе, некаторозе и в меньшей степени при трихоцефалезе.

В связи с высокой эффективностью и низкой токсичностью его широко применяют при лечении энтеробиоза у детей.

Принимают препарат внутрь (без приема слабительного) 1 раз в день (после завтрака) в виде таблеток или сиропа. Таблетки перед проглатыванием следует тщательно разжевать.

При энтеробиозе и аскаридозе назначают однократно.

Препарат обычно хорошо переносится; в отдельных случаях возможны тошнота, рвота, понос, головная боль, головокружение.

Препарат противопоказан при беременности.

ПИПЕРАЗИН (Piperazinum).

Диэтилендиамин.

Пиперазин и его соли оказывают противоглистное действие на различные виды нематод, особенно вызывающие аскаридоз и энтеробиоз (инвазии острицами). Они действуют как на половозрелых, так и на неполовозрелых особей обоего пола.

Пиперазин вызывает паралич мускулатуры гельминтов; в последующем они выводятся перистальтическими движениями кишечника. В 90 — 95 % случаев пиперазин освобождает организм от паразитов, при повторном применении можно достигнуть почти 100 % дегельминтизации.

Препараты пиперазина быстро всасываются при приеме внутрь. Выделяются в основном почками. Их применение не требует предварительной подготовки больных или содержания на специальной диете. Слабительные средства назначают лишь при склонности к запорам; дают их в дни приема пиперазина вечером.

Препараты пиперазина малотоксичны и в терапевтических дозах побочных явлений обычно не вызывают; могут применяться в амбулаторных условиях. Иногда наблюдаются легкая тошнота, боли в животе, скоропреходящая головная боль. При передозировке возможны мышечная слабость, тремор. У больных с нарушениями выделительной функции почек могут возникнуть нейротоксические явления.

Противопоказания: органические заболевания ЦНС.

Основным препаратом пиперазина, применяемым в качестве противоглистного средства, является пиперазина адипинат.

Пиперазина адипинат (Piperazini adipinas).

Синонимы: Adipalit, Adiprazina, Entacyl, Entazin, Helmirazin, Heltolan, Nematocton, Nometan, Oxurasin, Piperascat, Piperazine adipate, Piperazinum adipinicum, Vermicompren, Vermitox и дp.

При лечении аскаридоза назначают препарат 2 дня подряд по 2 раза в день за 1 ч или спустя 1/2 — 1 ч после еды.

Можно также принимать препарат в течение одного дня.

При лечении энтеробиоза необходимо строгое соблюдение гигиенического режима.

ЛЕВАМИЗОЛ (Levamisolum). (-) 2, 3, 5, 6-Тетрагидро-6-фенилимидазо-[2, 1-b]-тиазола гидрохлорид.

Синонимы: Аdiafor, Аscaridil, Саsydrol, Decaris, Еrgamisol, Кеtrax, Levasole, Lеvоripercol, Levotetramisol, Nilbutan, Sitraх, Теnisol и др.

Первоначально этот препарат был предложен в качестве противоглистного средства, так как он весьма эффективен в борьбе с аскаридами (см. Противоглистные средства). Лечебный эффект отмечается также при некаторозе, стронгилоидозе, частично при анкилостомидозе. Назначают при гельминтозах однократно перед сном. Соблюдения диеты не требуется.

Механизм антигельминтного действия основан на специфическом ингибировании сукцинатдегидрогеназы, в связи с чем блокируется важнейшая для нематод реакция восстановления фумарата и нарушается течение биоэнергетических процессов гельминтов.

При изучении антигельминтного действия левамизола было обнаружено, что он повышает общую сопротивляемость организма и может быть использован как средство для иммунотерапии. Опыты на изолированных клетках и наблюдения за здоровыми и больными людьми показали, что препарат способен восстановить измененные функции Т-лимфоцитов и фагоцитов и вследствие своего тимомиметического эффекта может регулировать клеточные механизмы иммунологической системы. Более подробные исследования продемонстрировали, что левамизол, избирательно стимулируя регуляторную функцию Т-лимфоцитов, может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослаблять сильную и не действовать на нормальную.

В связи с этими свойствами, левамизол был предложен для лечения различных заболеваний, в патогенезе которых придают значение расстройствам иммуногенеза: первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, аутоиммунные болезни, хронические и рецидивирующие инфекции, опухоли и др.

Наиболее изучено действие левамизола при ревматоидном артрите. Препарат относится к базисным средствам, действует при длительном применении; эффект развивается медленно (начиная примерно с 3-го месяца). Назначают препарат внутрь в суточной дозе 150 мг ежедневно (иногда дают прерывистыми курсами по 3 последующих дня в неделю).

Терапевтический эффект отмечен также у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких, получавших по 150 мг левамизола через день или по 100 мг в день. Выраженные клинические результаты и положительные сдвиги в иммунологических показателях отмечены у больных хроническим гломерулонефритом и пиелонефритом, принимавших левамизол по 150 мг 3 раза в неделю.

Включение левамизола (2 — 2, 5 мг/кг в сутки в течение 3 дней с перерывами между курсами 5 — 6 дней; всего 2 — 4 курса) в комплексную противоязвенную терапию благоприятно влияло на клиническое течение и рубцевание язвы двенадцатиперстной кишки у больных с неблагоприятным, часто рецидивирующим и затянувшимся течением заболевания. Помимо неблагоприятного течения заболевания, показанием к применению препарата служило снижение клеточного иммунитета (уменьшение количества Т-лимфоцитов, повышение количества В-лимфоцитов в периферической крови).

Имеются данные о положительном действии левамизола в комплексной терапии токсоплазмоза (в случаях хронического токсоплазмоза) со вторичным иммунодефицитом, связанным с нарушением активности Т- и В-лимфоцитов. Таким больным назначали левамизол по 150 мг 3 дня подряд с перерывами 1 нед между циклами, всего 2 — 3 цикла. Также использовали препарат для лечения кожных болезней — вульгарных и розовых угрей, псориаза.

Положительный эффект отмечен при применении левамизола в комплексной терапии больных с трудно поддающимися лечению формами шизофрении.

Левамизол, как иммуностимулируюший препарат может быть эффективен в комплексной терапии различных заболеваний. Однако, применять его необходимо с осторожностью и при соответствующих показаниях, в первую очередь, при показанном уменьшении активности Т-системы иммунитета. Дозы должны быть тщательно подобраны, так как при превышении доз, возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное действие, причем в некоторых случаях от малых доз левамизола.

Препарат может вызывать различные побочные явления. При однократном применении (для лечения гельминтозов) выраженных явлений не отмечено, однако при повторном применении, могут наблюдаться головная боль, нарушения сна, повышение температуры тела, изменение вкусовых ощущений, диспепсические явления, обонятельные галлюцинации (изменение запахов), аллергические кожные реакции, агранулоцитоз.

В процессе лечения левамизолом следует периодически (не менее чем через 3 нед) проводить анализы крови.

Препарат противопоказан в случае, если через 10 ч после первого приема в дозе 150 мг, количество лейкоцитов уменьшится ниже 3*10 9 /л (или при уменьшении количества нейтрофильных гранулоцитов до 1*10 9 /л).

ПРАЗИКВАНТЕЛЬ (Рraziquantel). 2-(Циклогексилкарбонил)-1, 2, 3, 6, 7, 11b-гексагидро-4Н-пиразино [2, 1-а] -изохинолин-4-он.

Синонимы: Biltride, Сеsol, Сеstox, Сistricid, Droncit, Рyquiton.

Отечественное название «Азинокс» (Аzinox) .

Белый кристаллический порошок, горький на вкус.

Является высокоэффективным средством для лечения шистосоматозов и трематодозов.

Быстро всасывается при приеме внутрь. Пик концентрации в плазме крови наблюдается через 1 — 2 ч. Быстро метаболизируется и выводится до 80 % в виде метаболитов почками в течение 4 сут, при этом 90 % выводится в первые 24 ч.

В механизме действия празиквантеля важное значение имеет повышение под его влиянием проницаемости клеточных мембран паразитов для ионов кальция. Препарат вызывает сокращение мускулатуры паразитов, переходящее в спастический паралич.

Назначают празиквантель внутрь в течение 1 — 2 дней. Принимают в сутки обычно по 25 мг/кг 3 раза или 30 — 40 мг/кг 2 раза.

Препарат дает высокий лечебный эффект (до 100 %) и обычно хорошо переносится. В отдельных случаях наблюдаются тошнота, головная боль, боли в эпигастральной области. Эти явления проходят обычно после окончания приема препарата.

По сравнению с хлоксилом празиквантель более эффективен и лучше переносится.

ФЕНАСАЛ (Рhenasаlum). 5, 2′-Дихлор-4′-нитросалициланилид.

Синонимы: Йомезан, Йомесан, Аtеn, Аtenase, Вiоmеsаn, Сеstocid, Copharten, Devermin, Grandal, Нelmiantin, Jometan, Kontal, Lintex, Niclosamidum, Radeverm, Teniarene, Vermitin, Yomesan и др.

Применяют как противоглистное средство при тениаринхозе (инвазии бычьим или невооруженным, цепнем), дифиллоботриозе (инвазии широким лентецом) и гименолепидозе (инвазии карликовым цепнем). По современным данным, фенасал является одним из наилучших противотениаринхозных средств.

Назначают фенасал внутрь.

При тениаринхозе и дифиллоботриозе принимают препарат утром натощак или вечером через 3 — 4 ч после легкого ужина. В день лечения рекомендуется жидкая или полужидкая, легкоусвояемая обезжиренная пища (жидкие каши, пюре, кисели, фруктовые соки и др.). Перед приемом фенасала дают 2 г натрия гидрокарбоната (питьевой соды).

Суточную дозу фенасала принимают однократно. Таблетки тщательно разжевывают или тщательно размельчают в теплой воде (1 таблетку в 1/4 стакана теплой воды).

Через 2 ч выпивают стакан сладкого чая с сухарями или печеньем. Слабительное не назначают.

При гименолепидозе суточную дозу фенасала делят на 4 разовые дозы, принимают через каждые 2 ч (в 10, 12, 14 и 16 ч). Пищу принимают в 8, 13 и 18 ч. Фенасал назначают в течение 4 дней. Через 4 дня курс лечения повторяют. Контрольное исследование проводят через 15 дней после окончания лечения и в последующем ежемесячно. При рецидиве заболевания лечение по указанной схеме повторяют; контрольные исследования проводят в течение 6 мес, а в упорных случаях — до 12 мес.

При тениозе принимают суточную дозу фенасала натощак, а через 2 ч солевое слабительное. Через 1 мес прием препарата повторяют. Слабительное не назначают.

Обычно фенасал хорошо переносится, но возможны тошнота, аллергические реакции, обострение нейродермита.

Покупка лекарства от гельминтов на сайте PetDog

Нижний Новгород. 22 сентября. НТА-Приволжье — Покупка лекарства от гельминтов на сайте PetDog

В нашем мире многие владельцы домашних животных стараются заботиться об их здоровье, потому, покупают антигельминтные средства, которые помогают избавить организм питомца от паразитов, что положительно скажется на здоровье. Покупка качественных препаратов является гарантом их эффективности, потому, обратитесь в магазин «PetDog » за помощью.

Особенности препаратов

Гельминты могут наблюдаться не только у уличных животных, но и у домашних собак, котов. Определить их наличие можно по следующим признакам:

• Нарушение работы пищеварительной системы, рвота, понос, запор, отказ от еды,
• Регулярный кашель,
• Желтый цвет слизистой оболочки,
• Гной из глаз, рта,
• Кровь в фекалиях,
• Интоксикация организма.

При наблюдении подобных признаков, надо обратиться к врачу. Животному будут прописаны подобные препараты с указанием дозировки. Также, это можно узнать из инструкции. Перед использованием препаратов, нужно избавиться от внешних паразитов, а именно блох. Иначе рекомендуется применять комплексные препараты, которые воздействуют на внешних и внутренних паразитов.

На сайте можно подобрать оптимальные препараты для индивидуальных ситуаций. Противопаразитные средства могут выпускаться в форме порошков, суспензий, эмульсий, гелей, таблеток. Применяются таблетки одним из способов:

• Смешивание с едой, желательно жидкой однородной консистенции.
• Растворение в воде, ввод за щеку шприцем.

Чтобы препараты дали нужный эффект, нужно строго следовать инструкции по применению и регулярно повторять введение в организм. Также, специалисты рекомендуют использовать данные препараты в качестве профилактики.

Выбор антигельминтных препаратов

Выбирая антигельминтные средства, нужно ориентироваться на следующие аспекты:

• Показатель эффективности,
• Ограничения по употреблению продуктов,
• Соответствие стандартам,
• Наличие побочных эффектов,
• Безопасность для животных,
• Срок годности,
• Удобство применения.

Ветеринары рекомендуют делать свой выбор в пользу комплексных, а не однокомпонентных препаратов. Хорошим выбором будут препараты на основе никлозамида, альбендазола и других. Заказ в данном магазине имеет ряд преимуществ:

• Большой выбор продукции отменного качества,
• Доступная цена товара,
• Возможность экономить за счет акций, скидок,
• Быстрый поиск товара на сайте,
• Консультация специалистов по выбору, применению препаратов.

Оформляйте заказ на сайте прямо сейчас, чтобы поправить здоровье питомца, пока не поздно.

*На правах рекламы. 22.09.2021 — 08:00

Все новости раздела «Новости ПФО»

Ученые ИЦиГ СО РАН разрабатывают антигельминтные препараты нового поколения

​Сибирские ученые подтвердили эффективность грибов лисичек в борьбе с описторхозом и в перспективе планируют создать на их основе антигельминтные препараты нового поколения, сообщает в пятницу Институт цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ СО РАН). 

В Институте отметили, что задача создания новых лекарственных препаратов против описторхоза очень актуальна, так как существующие обладают ограниченной результативностью и имеют серьезные побочные эффекты, а средства народной медицины зачастую малоэффективны. Между тем проблема описторхоза значима для многих регионов России, а территория Обь-Иртышского бассейна лидирует в РФ по распространению заболевания, которое может привести к серьезным патологиям, вплоть до онкологических заболеваний.

Старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов института Дамира Августинович считает, что наиболее перспективным для создания новых эффективных препаратов является изучение существующих природных соединений, к примеру грибов лисичек, экстракт которых в качестве противогельминтного средства уже применяется в китайской медицине.

«После серии экспериментов в лабораторных условиях ученые ИЦиГ совместно с сотрудниками Новосибирского института органической химии СО РАН и научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» не только подтвердили определенную эффективность лисичек в борьбе с описторхами, причем, без существенного побочного воздействия на организм, но и определили группу веществ, которые могут ее обеспечивать», — говорится в сообщении.

Следующий шаг, по словам ученых, протестировать каждое из соединений и выбрать кандидатов на роль будущих антигельминтных препаратов нового поколения. Кроме того, ученые работают над поиском возможных антигельминтных средств среди других природных соединений, модификацией существующих лекарств, и химическим синтезом новых препаратов.

Глистогонные препараты и нематоциды: исследования на Caenorhabditis elegans — WormBook

4. Классы глистогонных препаратов и нематоцидов

Глистогонные препараты и нематоциды разделены на классы на основе сходной химической структуры и механизма действия. Существует всего несколько основных классов, и каждый из них по очереди кратко обсуждается ниже. По большей части информация о физиологическом и фармакологическом действии этих соединений была получена в результате исследований на большой паразитической нематоде A.suum . C. elegans , с другой стороны, оказался ценным для определения молекулярных мишеней и последующих сигнальных каскадов.

4.1. Пиперазин

Пиперазин впервые был использован в качестве глистогонного средства в 1950-х годах, и он до сих пор является активным компонентом безрецептурных средств от инфекции нитчатого червя у детей. Его механизм действия в первую очередь изучался на A. suum , где он действует как слабый ГАМК-миметик и вызывает вялый обратимый паралич мышц стенки тела.Одноканальные записи свидетельствуют о низкой эффективности этого частичного агониста ГАМК-управляемых хлоридных каналов (Martin, 1985). Недавно действие пиперазина было исследовано на C. elegans путем сравнения его действия на unc-49 дикого типа и мутантов unc-49 , гена, который кодирует субъединиц рецептора C. elegans GABA _A , экспрессируемых в нервно-мышечное соединение стенки тела (Miltsch et al., 2013). Хотя требовались очень высокие концентрации (50-100 мМ), пиперазин оказывал аналогичное ингибирующее действие как на животных дикого типа, так и на мутантных животных unc-49 .В анализе развития C. elegans, пиперазин также оказывал одинаковое ингибирующее действие на мутанты unc-49 как дикого типа, так и unc-49. Возможно, что пиперазин не взаимодействует с UNC-49, но может взаимодействовать с другими предполагаемыми рецепторами GABA-управляемых хлоридных каналов, идентифицированными в геноме C. elegans , например, LGC-37, LGC-38 и GAB-1. .

4.2. Бензимидазолы: тиабендазол и альбендазол

Первый из этого класса, тиабендазол, был открыт в 1961 году, и впоследствии был введен ряд других бензамидазолов в качестве глистогонных средств широкого спектра действия.Об этих соединениях существует обширная литература, в которой сообщается о ряде различных биохимических эффектов. Тем не менее ясно, что их антигельминтная эффективность обусловлена ​​их способностью нарушать работу цитоскелета посредством избирательного взаимодействия с β-тубулином (Borgers and de Nollin, 1975; обзор см. В Lacey, 1990). Эффекты бензимидазолов на C. elegans , которые включают нарушение передвижения и репродукции, а также пагубное воздействие на ооциты, согласуются с нарушением процессов, требующих целостности микротрубочек.Чувствительность C. elegans к бензимидазолам опосредуется одним геном ben-1 , который кодирует β-тубулин (Driscoll et al., 1989). Это предоставило платформу для исследования молекулярных основ устойчивости к бензимидазолу у паразитических нематод. Было отмечено, что устойчивость к бензимидазолу у Haemonchus contortus , по-видимому, связана с присутствием специфических аллелей β-тубулина в изолятах, устойчивых к лекарствам (Kwa et al., 1994). Может ли конкретная изоформа β-тубулина вызывать устойчивость к препарату, было проверено в экспериментах, которые показали, что чувствительность C.elegans ben-1 мутантов бензимидазола могут быть спасены путем экспрессии аллеля β-тубулина H. contortus из чувствительных к бензимидазолу изолятов, но не могут быть спасены аллелем, присутствующим в устойчивых изолятах (Kwa et al., 1995). Это недвусмысленно продемонстрировало, что простая замена аминокислоты, Y на F, в β-тубулине может вызвать устойчивость к глистогонам. Это первый элегантный пример подхода «скачкообразной модели», в котором учитывается генетическая податливость C.elegans напрямую используется для определения функции гена паразитического червя. Взаимосвязь между генами β-тубулина у H. contortus и C. elegans более подробно исследована в Saunders et al. (2013).

4.3. Имидазотиазол: левамизол и тетрагидропиримидины: пирантел и морантел

Эти соединения обладают антигельминтным действием широкого спектра действия против нематод, но не действуют против цестод или трематод. Тетрамизол представляет собой рацемическую смесь изомеров L и D, а левамизол представляет собой чистый L-изомер.Пирантел и морантел структурно связаны друг с другом, но отличаются по структуре от левамизола и также являются эффективными глистогонными средствами.

Более 40 лет назад было показано, что тетрамизол (Aceves et al., 1970) и пирантел (Aubry et al., 1970) действуют как агонисты никотиновых рецепторов и вызывают спастический паралич мышц из-за длительной активации возбуждающих никотиновых рецепторов ацетилхолина. (нАХР) на мышцах стенки тела нематод. Исследования напряжения-фиксации с использованием мышечных клеток стенки тела A. suum показали, что морантел, пирантел и левамизол имитируют действие ацетилхолина в следующем порядке силы: морантел = пирантел> левамизол> ацетилхолин (Harrow and Gration, 1985). .Потенциал обращения для всех соединений составлял около +10 мВ, что указывает на то, что все они активируют одни и те же ионные каналы. Эти авторы также нашли доказательства того, что пирантел и ацетилхолин конкурируют за один и тот же рецептор. Их точный способ действия был тщательно изучен на одноканальном уровне на препарате мышцы стенки тела A. suum (см. Обзор в Martin et al., 2005). Фармакологический анализ предоставил доказательства наличия подтипов рецептора nACh (Qian et al., 2006), N-типа (предпочтительно активируемого никотином), B-типа (предпочтительно активируемого бефением) и L-типа (предпочтительно активируемого никотином) и L-типа (преимущественно активируемого никотином). левамизол и связанные с резистентностью к левамизолу).

Левамизол и родственные ему соединения также вызывают спастический паралич и откладывание яиц у C. elegans . Таким образом, C. elegans предоставил экспериментальную платформу для дальнейшего исследования молекулярной фармакологии имидазотиазолов и тетрагидропиримидинов на nAChR, и некоторые из этих работ теперь будут рассмотрены.

Прогрессивные генетические скрининги с использованием левамизола оказались чрезвычайно продуктивными. Первоначально использовался тетрамизол (Brenner, 1974), но позже его заменили левамизолом (Lewis et al., 1980а). Эти скрининги предоставили ресурс мутантов, которые использовались в течение последних двух-трех десятилетий для определения функций генов, экспрессируемых в нервно-мышечном соединении. Некоторые из них являются субъединицами nAChR, но другие, что интересно, таковыми не являются и служат либо для регулирования никотиновых рецепторов, либо для функции мышц. Список этих генов приводится вместе с их вероятными функциями.

Таблица

Таблица 2. Краткое описание функции гена для C. elegans мутанты, устойчивые к левамизолу.

Левамизол более эффективен, чем ацетилхолин, при сокращении сокращенных препаратов C. elegans , вызывая сокращение при низкой концентрации мкМ (Ruiz-Lancheros et al., 2011; Lewis et al., 1980b). У интактных животных ЕС ₅₀ для паралича, вызванного левамизолом, составляет 9 мкМ (Qian et al., 2008). Работа Fleming et al. (1997) предоставили доказательства роли UNC-38, UNC-29 и LEV-1 как субъединиц nAChR C. elegans . До этой работы было идентифицировано одиннадцать генов, обеспечивающих устойчивость к левамизолу (Lewis et al., 1987; Lewis et al., 1980b; Бреннер, 1974). Чрезвычайную устойчивость к левамизолу продемонстрировали следующие мутанты: lev-1, unc-29, unc-38, unc-63, unc-74, и unc-50 ; частичная устойчивость наблюдалась у мутантов к lev-8, lev-9, lev-10, unc-22, и unc-11 (последние два классифицированы как твичеры). Эксперименты с фиксацией напряжения на целых клетках с использованием клеток вентральной стенки тела C. elegans выявили доказательства наличия двух nAChR, рецептора, чувствительного к левамизолу, для активности которого требуются гены unc-38 и unc-29 , а также активированный рецептор. никотином и ацетилхолином, присутствующими в мутантах unc-38 и unc-29 , которые подверглись быстрой десенсибилизации (Richmond and Jorgensen, 1999).Они пришли к выводу, что N- (чувствительные к никотину) и L- (чувствительные к левамизолу) AChR вносят примерно равный вклад в ток ацетилхолина в мышцах стенки тела C. elegans . Эти результаты ясно демонстрируют, что левамизол оказывает прямое возбуждающее действие на мышцу стенки тела, которая представляет собой по крайней мере одно из участков антигельминтного действия левамизола. Последующая работа, в которой субъединицы AChR были экспрессированы в ооцитах Xenopus laevis , продемонстрировала, что для функционального рецептора требуется пять субъединиц: lev-1, lev-8, unc-29, unc-38, и unc-63 , вместе с тремя дополнительными факторами: ric-3, unc-50, и unc-74 (Boulin et al., 2008). Эта комбинация рецепторов реагировала и на ацетилхолин, и на левамизол, но не на никотин, который действовал как антагонист. Удаление любой из субъединиц значительно снизило ответ на оба соединения. Интересно, что когда эти авторы экспрессировали acr-16 вместе с ric-3 в ооцитах Xenopus , они получили большие токи к ацетилхолину и никотину, но левамизол не индуцировал ток. Было показано, что ряд вспомогательных факторов играют роль в сборке и функционировании L-nAChRs (19).Один из них, MOLO-1, физически взаимодействует с L-nAChR для увеличения гейтирования и, таким образом, является истинной вспомогательной трансмембранной субъединицей (Boulin et al., 2012). MOLO-1 взаимодействует с L-nAChR на ранней стадии секреторного пути и локализуется вместе с рецептором в нервно-мышечном соединении. Однако он не взаимодействует с N-nAChR. Другой фактор, miR-1, регулирует как чувствительность мышечных клеток к ацетилхолину через уровень экспрессии UNC-29 и UNC-63, так и количество ацетилхолина, высвобождаемого пресинаптическими нейронами через ретроградный мессенджер MEF-2 (Simon et al. ., 2008).

Эмбриональные клетки, выросшие из первичной культуры, развились в мышечные клетки L1 C. elegans , и их использовали для одноканальной записи от nAChRs (Rayes et al., 2007). Эти nAChR были чувствительны к левамизолу и показали единственную популяцию каналов с проводимостью 39 пСм, которая была в пять раз более чувствительна к левамизолу, чем к ацетилхолину. Наличие субъединиц UNC-38, UNC-63 и UNC-29 было важным для активности канала. Интересно, что мутанты lev-1 имели проводимость канала 26 пСм, с длительным временем открытия, но были менее чувствительны к левамизолу.Это показывает, что L-nAChR все еще могут функционировать в мышечных клетках L1 в отсутствие LEV-1. Используя этот препарат, пирантел и морантел также могут активировать одноканальные токи. Относительные силы тестируемых агонистов были морантел = пирантел> левамизол> ацетилхолин, в том же порядке, что и Харроу и Грейшн (1985) с использованием A. suum мышц стенки тела и записей напряжения. В более поздней работе (Hernando et al., 2012) было показано, что LEV-8 не важен для функциональных L-nAChR, хотя мутанты lev-8 показали кинетические изменения в свойствах каналов и были менее чувствительны к левамизолу.Эти авторы также показали, что хотя ACR-8 не требуется для L-nAChR дикого типа, он может заменять LEV-8 в мутантах lev-8 . лев-8; Двойной мутант acr-8 сильно устойчив к левамизолу. Поскольку ген, соответствующий lev-8 , не был обнаружен у нескольких видов трихостронгилидов, возможно, что acr-8 заменяет lev-8 у этих паразитических нематод (Neveu et al., 2010). Qian et al. (2008) также сделали одноканальные записи с C.elegans мышца стенки тела. В этих экспериментах они использовали lev-10 мутантов, в которых отсутствует агрегация nAChR, что позволяет осуществлять запись с одного канала. Средняя проводимость этих каналов составляла около 30 пСм при активации левамизолом или ацетилхолином. Эти активируемые левамизолом каналы были нечувствительны к никотину. Эти авторы обнаружили, что лев-8; Двойные мутанты lev-10 экспрессировали меньше каналов, которые также имели меньшую среднюю проводимость 26,9 пСм.Эти авторы рассматривают значение рецептора левамизола C. elegans в качестве модели паразитических нематод и отмечают, что в то время как C. elegans имеет активированные левамизолом каналы в диапазоне от 26 до 36 пс, в A. suum в диапазоне от 18-53 pS (Qian et al., 2006; Levandoski et al., 2005). Читателю предлагается ознакомиться с углубленным обзором исследования левамизола с использованием C. elegans и паразитических нематод, проведенного Martin et al. (2012b). В другом обзоре сравниваются nAChR C.elegans с таковыми паразитических нематод (Holden-Dye et al., 2013).

Левамизол не активирует N-nAChR в C. elegans , хотя он действительно действует как антагонист этих рецепторов (Ballivet et al., 1996). Дигидро-β-эритроидин также различает L- и N-nAChR, действуя как антагонист N-nAChR, но имеет очень слабый блокирующий эффект на L-nAChR (Richmond and Jorgensen, 1999). В отличие от L-nAChR, N-nAChR является гомомером, состоящим из пяти субъединиц ACR-16 и, вероятно, отвечает за все никотиновые синаптические события, не чувствительные к левамизолу, в нервно-мышечном соединении (Touroutine et al., 2005). Имеются доказательства того, что CWN-2 (лиганд Wnt), LIN-17 и CAM-1 (тирозинкиназа рецептора Ror) участвуют в контроле транслокации рецепторов ACR-16 (Jensen et al., 2012; Francis et al. ., 2005). Нейрональный рецептор ацетилхолина также был идентифицирован у C. elegans и имеет следующий состав: UNC-38, UNC-63, ACR-2, ACR-2 и ACR-12 (Jospin et al., 2009). При экспрессии в ооцитах Xenopus этот рецептор почти полностью нечувствителен к левамизолу и слабо активируется никотином, но действие ацетилхолина явно блокируется мекамиламином.Для экспрессии в ооцитах необходимо было совместное введение unc-50, unc-74, и ric-3, в дополнение к пяти холинергическим субъединицам .

Таким образом, C. elegans предоставил полезную платформу для исследования молекулярной фармакологии этих классов соединений, и, в свою очередь, эти антигельминтики продолжают предоставлять важные фармакологические инструменты для анализа подтипов и стехиометрии нативных никотиновых рецепторов нематод.

4.4. Спироиндолы: парагерквамид и деркуантел (2-дезоксипарагерквамид / PNU 141962)

Парагерквамид А и маркофортин А являются членами семейства оксиндольных алкалоидов, первоначально выделенных из Penicillium paraherquei и P. roqueforti , соответственно (P. roqueforti , соответственно, ., 2002). Их химический состав, эффективность и способ действия были рассмотрены (Lee et al., 2002). Специфический сайт связывания с высоким сродством для парагерквамида был идентифицирован в препарате мембраны, выделенном из C.elegans с кажущейся Kd 263 нМ (Schaeffer et al., 1992). Парагерквамид и его производное, 2-дезоксипарагерквамид (деркуантел), вызывают вялый паралич у паразитарных нематод in vitro . Фармакологический анализ эффектов этих препаратов на стимулированные ацетилхолином сокращения мышц стенки тела в мышечных полосках A. suum in vitro показал, что они действуют как типичные конкурентные антагонисты, сдвигая кривые концентрация-ответ вправо параллельно. мода (Робертсон и др., 2002). Эти препараты не оказывают очевидного прямого действия на напряжение мышц стенки тела A. suum или мембранный потенциал (Lee et al., 2002). Парагерквамид также блокирует действие других никотиновых агонистов, но не в равной степени (Robertson et al., 2002; Zinser et al., 2002). Интересно, что этот антагонист, по-видимому, различает подтипы никотиновых рецепторов в мышцах и имеет большее сродство к рецепторам, опосредующим ответ на левамизол и пирантел, чем к рецепторам, которые опосредуют ответ на никотин.Запись патч-зажим от мышцы стенки тела A. suum обнаружила по крайней мере три подтипа нАХР на основе проводимости, а именно N, L и B, с проводимостью 22/24 пс, 33/35 и 45 пс. соответственно (Qian et al., 2006). Подтверждая предыдущие исследования, парагерквамид не смог противодействовать подтипу N (никотин-чувствительный), подтип L (чувствительный к левамизолу) противодействовал парагерквамиду, а подтип B (чувствительный к бефению) был более антагонистом 2-дезоксипарагерквамида, чем парагерквамида.При использовании нарезанного препарата C. elegans было показано, что 2-дезоксипарагерквамид парализует C. elegans и противодействует действию бефения, предпочтительнее пирантела и, в меньшей степени, левамизола на этот препарат; то есть bephenium> pyrantel> levamisole, что указывает на предпочтение nAChRs подтипа B (Ruiz-Lancheros et al., 2011). 2-дезоксипарагерквамид противодействовал никотину только 10 мкМ, поэтому было трудно сравнивать чувствительность никотина к 2-дезоксипарагерквамиду по сравнению с другими агонистами никотина.Дезокспарагерквамид оказался более сильным антагонистом по сравнению с мекамиламином. Эти авторы высказали предположение, что кутикула C. elegans может быть менее проницаемой, чем кутикула паразитических нематод, что может повлиять на ценность C. elegans в качестве первичного скрининга на антигельминтики.

Важно отметить, что механизм действия этого класса глистогонных средств отличается от более известных препаратов, которые препятствуют холинергической передаче (например,, левамизол), поскольку они действуют как конкурентные антагонисты, а не холиномиметики. Об использовании парагерквамида в прямых генетических скринингах еще не сообщалось, но потенциально он может генерировать новые интересные мутанты. Поскольку он является конкурентным ингибитором рецептора nACh стенки тела, можно предположить, что мутации, которые увеличивают высвобождение медиатора, должны вызывать устойчивость. Таким образом, прямой генетический скрининг может выявить дополнительные негативные регуляторы высвобождения нейромедиаторов. Обзор, посвященный открытию, принципу действия и использованию 2-дезоксипарагерквамида в сочетании с абамектином в качестве глистогонного средства Startect, см. В Woods et al.(2012).

4.5. Макроциклические лактоны; авермектины и милбемицины; ивермектин и моксидектин

Ивермектин был представлен как глистогонное средство в 1980-х годах компанией Merck. Это полусинтетическое производное авермектина, который представляет собой крупный макроциклический лактонный продукт ферментации микроорганизма Streptomyces avermitilis . Это удивительно мощный (~ 1 нМ) и стойкий эффект, и его открытие вдохновило другие компании инвестировать в разработку аналогов ивермектина, включая моксидектин, милбемицин оксим, дорамектин, селамектин, абамектин и эприномектин.Здесь C. elegans сыграли свою роль, так как он был использован в скрининге дополнительных макроциклических лактонов с ивермектин-подобной активностью (Haber et al., 1991).

Ивермектин вызывает сильный и стойкий паралич глотки нематод (Pemberton et al., 2001; Brownlee et al., 1997) и мускулатуру стенки тела (Kass et al., 1982; Kass et al., 1980). Было показано, что он взаимодействует с рядом лиганд-управляемых ионных каналов, включая α7 nACh-рецепторы (Krause et al., 1998), управляемые ацетилхолином хлоридные каналы (Bokisch and Walker, 1986), GABA-управляемые хлоридные каналы (Holden-Dye и Walker, 1990; Robertson, 1989), хлоридные каналы, управляемые гистамином (Zheng et al., 2002), рецепторы глицина (Shan et al., 2001) и рецепторы P2X4 (Khakh et al., 1999). Однако именно его высокое сродство к глутаматным хлоридным каналам нематод (GluCl) коррелирует с его мощной антигельминтной активностью. Это было определено командой из Merck, которой удалось клонировать экспрессию субъединиц ионных каналов GluClα и GluClβ из C. elegans (Cully et al., 1994). Обе субъединицы экспрессировались либо по отдельности, либо вместе в ооцитах Xenopus . GluClα реагирует на микромолярный ивермектин, но не на глутамат, тогда как GluClβ реагирует на глутамат, но не на ивермектин.Совместная экспрессия GluClα и GluClβ дает канал, который отвечает на глутамат и положительно аллостерически модулируется наномолярным ивермектином. Впоследствии было идентифицировано небольшое семейство генов нематод, кодирующих каналы GluCl (для обзора см. Yates et al., 2003). Номенклатура сбивает с толку, поскольку одни и те же гены были обнаружены как методами гомологического скрининга, так и в результате прямого генетического скрининга генов устойчивости к ивермектину. По сути, существует четыре гена C. elegans , кодирующих субъединицы GluClα, два из которых поочередно сплайсируются с образованием каналов GluCl: GluClα1, кодируемый glc-1 , GluClα2A и B, кодируемый avr-15 , GluClα3A и B, кодируемый avr-14 и GluClα4, кодируемый glc-3 , ().Существует только одна субъединица GluClβ, кодируемая glc-2, и еще один ген, glc-4 , который отличается от генов, кодирующих субъединицы α и β. Хотя фармакология каналов, собранных из этих субъединиц GluCl, была определена в гетерологичных системах экспрессии, важный вопрос о стехиометрии субъединиц и фармакологии нативных каналов определен гораздо хуже. Дальнейшие исследования C. elegans обеспечивают лучшее понимание этого, очерчивая паттерн экспрессии субъединиц GluCl в нервной системе.Например, глоточная мышца экспрессирует avr-15 и glc-2 (Dent et al., 1997; Laughton et al., 1997). Таким образом, можно ожидать, что субъединицы GluClα2 и GluClβ совместно собираются с образованием нативного ивермектин-чувствительного канала. Вкладывают ли другие субъединицы в функциональный рецептор или нет, пока не ясно. Однако глоточная мышца мутантов avr-15 и не отвечает на ивермектин (Pemberton et al., 2001; Dent et al., 1997), что явно указывает на участие GluClα2.В отношении места антигельминтного действия ивермектина важно отметить, что, хотя глотки мутантов avr-15 не ингибируются ивермектином, популяции мутантов avr-15 , подвергшиеся воздействию ивермектина, все еще парализованы. Таким образом, каналы GluCl в глотке не требуются для паралитического эффекта. Это также может относиться к паразитическим нематодам. Например, ивермектин обладает антигельминтным действием против Ascaridia galli , но глотка этого вида не подавляется лекарством (Holden-Dye and Walker, 2006).

Таблица

Таблица 3. Сводная информация о субъединицах рецепторов хлорида, управляемых глутаматом, и их экспрессии в C. elegans.

Для лучшего понимания роли каналов GluCl в опосредовании паралитического действия ивермектина, вероятно, наиболее информативно рассмотреть их роль в двигательной нервной системе. В настоящее время большая часть информации доступна для avr-14 и avr-15 . Эти гены экспрессируются в двигательной нервной системе C.elegans (Dent et al., 2000; Dent et al., 1997) и имеется иммуноокрашивание на GluClα3A и B в моторнейронах паразитической нематоды H. contortus (Portillo et al., 2003). Одна роль этих каналов GluCl в C. elegans заключается в регуляции продолжительности поступательного движения, хорошо известного глутаматергического регулируемого поведения (см. Ионотропные рецепторы глутамата: генетика, поведение и электрофизиология). Эта функция может сохраняться между C. elegans и H.contortus как субъединиц GluClα3 H. contortus , экспрессируемых в C. elegans avr-14 мутанты восстанавливают паттерн движения дикого типа (Cook et al., 2006). Наиболее вероятно, что паралитическое действие ивермектина происходит из его мощной активации GluCl в двигательной нервной системе нематод. Однако точная роль отдельных каналов GluCl в опосредовании эффектов ивермектина на эти цепи еще не установлена. Механизм устойчивости к ивермектину также был изучен у C.elegans . Высокий уровень устойчивости — сложное явление, требующее мутаций по крайней мере в трех генах: glc-1 , avr-14, и avr-15 . Другие гены, регулирующие проницаемость мембран ( osm-1 ) и щелевые соединения ( unc-7 и unc-9 ), также участвуют (Dent et al., 2000). Определение роли мутаций GluCl в придании устойчивости к ивермектину паразитическим нематодам в полевых условиях является менее решаемой и более спорной проблемой (Wolstenholme et al., 2004).

Было обнаружено, что ивермектин взаимодействует с субъединицами AVR-14, расположенными в мышечном слое выделительно-секреторного аппарата микрофилярий Brugia malayi (Moreno et al., 2010). Обработка микрофилярий ивермектином in vitro снижает количество белков, выделяемых экскреторно-секреторным аппаратом. Предполагается, что in vivo отсутствие этих белков больше не позволяет микрофиляриям преодолевать иммунную систему хозяина, и поэтому они быстро выводятся из организма хозяина.

C. elegans был использован для изучения устойчивости к ивермектину, которая может включать изменения активности P-гликопротеина (члены надсемейства переносчиков ABC, для обзора см. Ardelli, 2013). Повышенная экспрессия генов pgp привела к повышенной устойчивости к ивермектину (James and Davey, 2009), в то время как потеря функции отдельных P-гликопротеинов привела к повышенной чувствительности к ивермектину (Ardelli and Prichard, 2013; Janssen et al., 2013). В своем исследовании Джеймс и Дэйви (2009) выявили C.elegans к увеличению концентрации ивермектина. Повышенная устойчивость была связана с повышенной экспрессией белков множественной лекарственной устойчивости и генов Р-гликопротеина. Штаммы, показавшие устойчивость к ивермектину, также показали устойчивость к моксидектину, левамизолу и пирантелу, но не к альбендазолу. Инактивация pgp-1, -5, -6, -12, и -13 вызывала повышенную чувствительность к ивермектину (Ardelli and Prichard, 2013). Эти гены в основном экспрессируются в кишечнике, глотке и амфидах.Арделли и Причард (2013) предполагают, что ивермектин может действовать несколькими способами.

В попытке определить различия между механизмом действия ивермектина и моксидектина Ardelli et al. (2009) исследовали их действие на глоточную помпу, развитие и перемещение у мутантов дикого типа и глутамат-управляемых хлоридных каналов у C. elegans. Результаты обобщены, из которых видно, что существуют различия между двумя глистогонными средствами.Хотя активность обоих глистогонных средств теряется в отсутствие AVR-14, AVR-15 и GLC-1, примечательно, что мутанты glc-2 показали повышенную подвижность при применении 2,5 нМ моксидектина в течение первых 90 минут. эффект не наблюдается с ивермектином. Глоточная помпа мутанта glc-2 была одинаково чувствительна как к ивермектину, так и к моксидектину, тогда как моксидектин дикого типа был более чем в 10 раз менее активен по сравнению с ивермектином. В целом мутанты glc-4 были более чувствительны к обоим глистогонным средствам.

Таблица

Таблица 4. Различное действие ивермектина и моксидектина на C. elegans . Сравнение концентраций (в нМ) ивермектина и моксидектина, необходимых для остановки личиночного развития, подвижности и глоточной перекачки у животных дикого типа и глутамат-управляемых (подробнее …)

Информация, касающаяся связывания ивермектина и механизма его активации продвинулась с публикацией кристаллической структуры ивермектина, связанного с C.elegans гомомерный пентамер αGluClR (Lynagh, Lynch, 2012; Hibbs, Gouaux, 2011). Ивермектин связывается на границе трансмембранного домена двух соседних субъединиц, зажатых между M3 из основной субъединицы (M3 (+)) и M1 из комплементарной субъединицы (M1 (-)). Таким образом, ивермектин перестраивает спиральную организацию трансмембранного домена, чтобы открыть канал. Это структурное изменение, вызванное ивермектином для открытия поры канала, отличается от такового, вызванного глутаматом (Lynagh and Lynch, 2012).Исследования, подобные этим, на C. elegans дают более глубокое понимание механизма действия этого важного класса глистогонных средств.

Один из макроциклических лактонов, абамектин, также оказался полезным в качестве нематицида и продается как средство для обработки семян (Avicta) для защиты растений от инвазии нематод, паразитирующих на растениях. Предположительно, экстраполяция из C. elegans , абамектин проявляет свое действие через глутаматные хлоридные каналы у паразитических нематод растений, но это еще не изучено.

4.6. Циклооктадепсипептиды: эмодепсид и PF1022A

Молекула циклооктапсипептида эмодепсид представляет собой полусинтетическое производное PF1022A, продукта ферментации, полученного из гриба Mycelia sterilia , из Camelia japonica . Его открытие и глистогонная активность описаны в Harder and von Samson-Himmelstjerna (2002) и недавно были рассмотрены (Krucken et al., 2012). Он эффективен против изолятов паразитов, устойчивых к бензимидазолу, левамизолу и ивермектину, что, что важно, указывает на новый механизм действия.Молекула обладает порообразующими свойствами в плоских липидах, однако это, по-видимому, не важно для придания ее глистогонной активности, поскольку оптический изомер эмодепсида с аналогичными порообразующими свойствами не обладает глистогонным действием. Таким образом, похоже, что он может действовать через стереоспецифическое связывание с рецептором. Исследования A. suum выявили паралич мышц и указали на механизм действия, зависимый от кальция и калия (Willson et al., 2003). Рецептор-кандидат для циклодепсипептидов был клонирован из H.contortus путем иммуноскрининга с использованием антитела к PF1022 A. Этот рецептор, обозначенный как HC110R, был экспрессирован в клетках HEK293 и, как было показано, блокирует приток кальция PF1022 A-зависимым образом (Saeger et al., 2001). Он гомологичен латрофилинам млекопитающих, классу рецепторов, связанных с G-белком, которые связывают нейротоксин, латротоксин. Латротоксин парализует млекопитающих, вызывая высвобождение нейромедиаторов, и, таким образом, идентификация латрофилина как рецептора эмодепсида повысила интригующую возможность того, что эмодепсид может вызывать паралич нематод, стимулируя чрезмерное высвобождение нейромедиаторов в нервно-мышечных участках.

C. elegans очень чувствителен к эффектам эмодепсида в наномолярных концентрациях (Bull et al., 2007). Эффекты включают замедленное развитие, подавление глоточной перекачки, снижение локомоции (движение вперед сильнее всего сказывается при низких концентрациях) и подавление яйцекладки, приводящее к «мешкованию» у взрослых гермафродитов. Таким образом, C. elegans предоставил отличную модель для определения молекулярной мишени или мишеней, через которые эмодепсид проявляет свое плейотропное действие, и действительно для проверки, участвуют ли латрофилины.

Есть два гена, кодирующие латрофилины-кандидаты в C. elegans , lat-1 и lat-2 . Роль этих латрофилинов в опосредовании ингибирующих эффектов эмодепсида на питание и передвижение была исследована с использованием РНКи и нокаута генов (Bull et al., 2007; Guest et al., 2007; Willson et al., 2004). Глоточная система мутантов lat-1 демонстрирует пониженную чувствительность к эмодепсиду, но их двигательная активность подавляется аналогично животным дикого типа (Guest et al., 2007). Эмодепсид не оказывает ингибирующего действия на передвижение через другой латрофилин, LAT-2, поскольку мутанты lat-2 реагируют так же, как животные дикого типа. Также нет избыточности функций между LAT-1 и LAT-2 с точки зрения эффекта эмодепсида на локомоцию, как у двойного мутанта lat-2; lat-1 отвечает на эмодепсид аналогично одиночному мутанту lat-1 (Guest et al., 2007). Очевидно, что эмодепсид обладает латрофилин-независимым действием.

Прямые генетические скрининги предоставили дальнейшее понимание механизма, посредством которого эмодепсид оказывает свое ингибирующее действие на мышцы C. elegans (Guest et al., 2007). Скрининг химического мутагенеза двадцати тысяч геномов на предмет мутантов, которые могут перемещаться и размножаться на микромолярном эмодепсиде, выявил девять аллелей одного гена, slo-1 . Штаммы, несущие функциональные нулевые аллели slo-1 , обладают высокой устойчивостью к ингибирующим эффектам эмодепсида на передвижение и питание.Кроме того, штаммы, несущие аллели усиления функции slo-1 , ведут себя аналогично животным, получавшим эмодепсид, но сами по себе не являются гиперчувствительными к эмодепсиду. Эти данные убедительно подтверждают утверждение, что эмодепсид активирует SLO-1-зависимый путь, вызывая нервно-мышечное торможение.

SLO-1 представляет собой активируемый кальцием калиевый канал (Wang et al., 2001), гомологичный BK-каналам млекопитающих. Таким образом, открытие SLO-1 как важного эффектора для эмодепсида перекликается с более ранней работой над мышцами Ascaris , которые показали зависимую от кальция и калия гиперполяризацию (Willson et al., 2003). Этот канал является высококонсервативным во всех типах животных и играет ключевую роль в регуляции возбудимости нейронов и мышечных клеток (для обзора, Salkoff et al., 2006). У C. elegans он широко экспрессируется в нервной системе и мышцах стенки тела, но не в мышцах глотки. Путем экспрессии копии slo-1 дикого типа в определенных подмножествах клеток на нулевом фоне slo-1 было показано, что эмодепсид может подавлять двигательную активность, когда SLO-1 присутствует в нейронах или мышцах стенки тела ( Гость и др., 2007).

Поскольку каналы BK широко распространены у животных, включая виды-хозяева для нематод, было исследовано влияние эмодепсида на C. elegans, , где нативные каналы SLO-1 были заменены ортологом млекопитающих, каналом KCNMA1 человека ( Crisford et al., 2011). C. elegans slo-1 мутанты демонстрируют определенные поведенческие дефекты, которые были восстановлены, когда у этих мутантов было экспрессировано kcnma1 , что указывает на то, что каналы KCNMA1 могут функционировать в C.elegans. Животные, экспрессирующие kcnma1 вместо slo-1 , были от 10 до 100 раз менее чувствительны к эмодепсиду. Интересно, что изгибы тела C. elegans , экспрессирующих kcnma1 , уменьшались в присутствии как NS 1619, так и роттлерина (маллотоксина), обоих агонистов BK-каналов млекопитающих (Захаров и др., 2005; Олесен и др., 1994) , но ни одно соединение не оказало никакого эффекта на C. elegans дикого типа . Crisford et al. (2011) также исследовали влияние эмодепсида на C.elegans slo-1 мутантов, у которых slo-1 эктопически экспрессировался в глоточной мышце. Обычно slo-1 не экспрессируется в мышцах глотки на обнаруживаемых уровнях, но избирательно экспрессируется в нейронах глотки (Chiang et al., 2006; Wang et al., 2001). Дальнейшие эксперименты показали, что при селективной экспрессии slo-1 дикого типа в глоточной мышце C. elegans slo-1 мутанты эмодепсид подавляли глоточную перекачку, обеспечивая дополнительные доказательства того, что SLO-1 является основной мишенью для эмодепсида в . С.elegans. Взаимодействие между генами канала SLO-1 из Ancylostoma caninum и Cooperia oncophora и эмодепсидом, экспрессируемым в C. elegans , также было исследовано (Welz et al., 2011). Когда slo-1 из A. caninum и C. oncophora были экспрессированы в мутантах C. elegans slo-1 , их чувствительность к эмодепсиду была восстановлена, что свидетельствует о том, что эмодепсид может действовать на каналы SLO-1 из паразитические нематоды и для C.elegans как отличная модель для таких исследований экспрессии. Кроме того, эти авторы показали, что пенитрем A, ингибитор BK-каналов (Knaus et al., 1994), блокировал эффект эмодепсида у C. elegans , что предоставило дополнительные доказательства того, что каналы SLO-1 являются местом действия эмодепсида. у нематод. Если исходить из предположения, что основной целью эмодепсида является SLO-1, возникает вопрос, активирует ли эмодепсид действие SLO-1 или подавляет его. Предварительные данные позволяют предположить, что эмодепсид способствует активации каналов SLO-1, гетерологично экспрессируемых в клетках HEK293 (Holden-Dye et al., 2012). В недавнем обзоре суммируются исследования эмодепсида и значение C. elegans для выяснения механизма его действия (Krucken et al., 2012).

Открытие SLO-1 в качестве посредника ингибирующих эффектов эмодепсида на C. elegans является важным достижением в этой области, которая в свете устойчивости к ивермектину имеет острую необходимость в таких открытиях. В более широком контексте появляется все больше данных, указывающих на то, что каналы BK, такие как SLO-1, могут играть ключевую роль в обеспечении чувствительности к нейроактивным лекарствам, включая этанол и местные анестетики (Dillon et al., 2013; Хавасли и др., 2004; Davies et al., 2003), а также в регулировании паттерна активности нейронных сетей (Salkoff et al., 2006). Таким образом, дополнительным и ценным аспектом этих исследований является то, что эмодепсид предоставляет новый инструмент для анализа функциональной роли SLO-1 в нейронных сетях, используя возможности молекулярной генетики в C. elegans . Недавние обзоры суммируют доказательства того, что SLO-1 является основным местом-мишенью эмодепсида у C. elegans и паразитических нематод (Holden-Dye at al., 2012; Martin et al., 2012a). Текущие данные свидетельствуют о том, что эмодепсид действует как на рецепторы латрофилина, так и на каналы SLO-1 в глоточной системе, подавляя перекачивание крови, но только на каналы SLO-1 в мышцах стенки тела, подавляя передвижение.

4,7. Тиазолид: нитазоксанид

Нитазоксанид, ингибитор пирувата: ферредоксин оксидоредуктазы, действует против широкого спектра простейших и гельминтов, которые встречаются в кишечном тракте. Фермент, на который он нацелен, необходим для поддержания переноса электронов во время анаэробного дыхания.В настоящее время он используется для лечения протозойных инфекций (и поэтому не включен в список). Место действия этого соединения не установлено у нематод, хотя анаэробные ферменты переноса электронов могут быть потенциальной мишенью (Gilles and Hoffman, 2002). Эффект нитазоксанида был изучен на рост и развитие C. elegans (Fonseca-Salamanca et al., 2003). После семи дней культивирования нитазоксанид (100 мкМ) снизил рост популяции только на 33%. Напротив, мебендазол (5 мкМ) и альбендазол (1 мкМ) снижали рост более чем на 90%.Нитазоксанид (100 мкМ) не влиял ни на эмбрионирование, ни на вылупление у Heligmosomoides polygyrus. Следовательно, эффективность этого соединения относительно низкая по сравнению с другими глистогонными средствами. Нитазоксанид также не проявил большой активности против Trichuris muris или Ancylostoma ceylanicum in vivo (Tritten et al., 2012). Было обнаружено, что нитазоксанид ингибирует синтез АТФ у C. elegans (Hemphill et al., 2006).

4.8. Производные аминоацетонитрила: monepantel

В ходе исследований новых антигельминтных средств, действующих через новые сайты, производные аминоацетонитрила (AAD) были идентифицированы с использованием анализа развития личинок против бензимидазолустойчивого изолята H.contortus (Ducray et al., 2008). Эти авторы отметили, что, хотя N-ациламиноацетонитрилы использовались против насекомых, грибов и бактерий, они ранее не тестировались против нематод. Последующие исследования показали, что AAD активны против ряда нематод, включая различные стадии Cooperia oncophora, Trichostrongylus colubriformis, Ostertagia ostertagi, Nematodirus spathiger, Teladorsagia Circiccta, и Chabertia ovina и др., (Kaminskya, 2008).После тестирования ряда AAD на их глистогонную активность, включая их эффективность и переносимость у овец и крупного рогатого скота, AAD-1566 был выбран для углубленного исследования на овцах и получил название монепантел (Kaminsky et al., 2008b; Kaminsky and Rufener, 2012). AAD были эффективны против нематод, показавших устойчивость к левамизолу, ивермектину и / или альбендазолу (Kaminsky et al., 2008a). Монепантел также более эффективен как глистогонное средство по сравнению с деркуантелом в комбинации с абамектином, когда овец лечили мультирезистентным препаратом H.contortus (Sager et al., 2012).

Прямой генетический скрининг на устойчивость к аминоацетонитрилу с использованием мутантов C. elegans выявил два возможных гена, acr-17 и acr-23 , оба являются членами группы субъединиц никотиновых рецепторов DEG-3 в C. elegans (Каминский и др., 2008а). ACR-23, а не ACR-17, был идентифицирован как основной фактор, способствующий ответу на AAD гиперсокращения мышц стенки тела и параличу, то есть действуя как агонист ацетилхолина.Интересно, что группа никотиновых субъединиц DEG-3 не присутствует у млекопитающих (Mongan et al., 2002), что согласуется с наблюдением, что monepantel хорошо переносится хозяином. Дальнейшие проверки в H. contortus были проведены для идентификации молекулярной мишени у паразитических нематод. Были идентифицированы три линии H. contortus , устойчивые к AAD, все из которых несли мутации в гене, кодирующем субъединицу никотинового рецептора ACh, Hco-des-2H (Kaminsky et al., 2008а). Однако мутант C. elegans , лишенный гомологичной субъединицы рецептора DES-2, не был устойчив к AAD. Две из этих линий H. contortus также несли мутации в Hco-acr-23H, , который теперь называется Hco-mptl-1 (Rufener et al., 2009). Это поднимает вопрос о роли этих субъединиц в обеспечении антигельминтного действия монепантела. Фармакология субъединиц, Hco-deg-3 и Hco-des-2 , была исследована более подробно посредством экспрессии в ооцитах Xenopus , и что интересно, гетеромер этих субъединиц оказался более чувствительным к холину. чем с ацетилхолином (Rufener et al., 2010а). Монепантел и монепантел сульфон, основной метаболит монепантела у овец (Karadzovska et al., 2009), оба усиливают холин-индуцированные токи, что указывает на то, что они действуют как положительные аллостерические модуляторы этих каналов. Rufener et al. (2010a) были неспособны экспрессировать Hco-mptl-1 в ооцитах Xenopus , возможно потому, что рецептору HcoMPTL-1 требуется специфический шаперон и / или дополнительные субъединицы AChR для функциональности; следовательно, прямые доказательства того, что эта субъединица чувствительна к монепантелу, отсутствуют.Тем не менее, существуют дополнительные доказательства того, что субъединица ACR-23 / MPTL-1 является основной мишенью для монепантела, поскольку, когда эта субъединица отсутствует у нематоды, например, Pristionchus pacificus или Strongyloides ratti, эти виды относительно нечувствительны к monepantel (более чем в 100 раз менее чувствителен по сравнению с C. elegans ) (Rufener et al., 2010b). История монепантела от его открытия до способа действия была недавно обобщена (Kaminsky and Rufener, 2012), а также недавно было опубликовано сравнение свойств монепантела, эмодепсида и деркуантела (Epe and Kaminsky, 2013).

4.9. Аминофениламидины: амидантел и трибендимидин

Более 30 лет назад амидантел (Bayd 8815) был представлен в качестве нового глистогонного средства против анкилостомы, A. caninum и Unicinaria stencephala (Thomas, 1979). Амидантел и его производные, включая трибендимидин, были позже синтезированы в Китае и изучены на предмет биологической активности (Xiao et al., 2013; Xiao et al., 2005). Трибендимидин был особенно активен против Ascaris lumbricoides и Necator americanus .В попытке идентифицировать место действия трибендимидина был предпринят прямой генетический скрининг мутантов, устойчивых к трибендимидину, с использованием C. elegans (Hu et al., 2009). C. elegans дикого типа были парализованы при воздействии 220 мкМ трибендимидина, и более тщательное изучение показало дегенерацию их внутренней структуры. Развитие личинок L1 в этой концентрации также задерживалось. На своем экране Ху и др. (2009) идентифицировали десять устойчивых животных, которых они разделили на четыре группы: trb-1, trb-2, trb-3, и trb-4 .Эти мутанты имели нормальный размер выводка в присутствии трибендимидина, в то время как у C. elegans дикого типа размер выводка был уменьшен. Hu et al. (2009) обнаружили, что мутанты трибендимидина также были устойчивы к левамизолу и пирантелу, что указывает на то, что устойчивые к трибендимидину C. elegans также были устойчивы к агонистам nAChR L-подтипа, что указывает на общую мишень для трибендимина и левамизола, L-nAChR. Более того, они обнаружили, что trb-1 до -4 коррелировали с генами, уже идентифицированными для устойчивости к левамизолу: unc-63, lev-8, unc-50, и unc-22 , соответственно.Кроме того, было показано, что устойчивость к трибендимидину имела место у одиннадцати дополнительных мутантов, устойчивых к левамизолу. Действие трибендимидина на мутантов C. elegans , лишенных компонентов L-nAChR, было исследовано (Miltsch et al., 2013), где unc-38, unc-63, lev-1, или lev-8 мутанты имели значительно сниженную чувствительность к глистогонным средствам, демонстрируя важность всех этих субъединиц для действия трибендимидина. Таким образом, с использованием C. elegans было показано, что трибендимидин и левамизол действуют на один и тот же рецептор, и поэтому нематоды, устойчивые к левамизолу, также могут быть устойчивы к трибендимидину.Левамизол внесен в список как глистогонное средство для людей (Примерный перечень основных лекарственных средств ВОЗ, 2013 г.), но редко используется на практике из-за низкого терапевтического индекса.

4.10. Белки Crystal (Cry) из

Bacillus thuringiensis : Cry5B, Cry21A

Cry белки представляют собой порообразующие белки, вырабатываемые грамположительной бактерией Bacillus thuringiensis (Hu and Aroian, 2012a; Hu and Aroian, 2012b). Хотя эти соединения впервые использовались в качестве инсектицидов, с тех пор было показано, что они обладают глистогонными свойствами, в том числе против C.elegans (Kotze et al., 2005; Wei et al., 2003). Когда Cry5B скармливают C. elegans , происходит повреждение его кишечника, уменьшение размера расплода примерно с 250 до 5 и гибель (Marroquin et al., 2000). Эти авторы разработали генетический скрининг для выявления мутантов, устойчивых к Cry5B. Мутанты были названы bre- мутантами, B acillus-toxin re sistant, и было идентифицировано пять генов: bre-1, -2, -3-4 и -5 . Кишечник всех пяти мутантов не был затронут Cry5B, в то время как мутанты bre были сильно устойчивы к смерти, индуцированной Cry5B.Влияние Cry5B на размер расплода также было значительно снижено у этих мутантов. Та же группа в более поздней работе клонировала bre-1 и охарактеризовала его фенотип (Barrows et al., 2007). bre-1 кодирует фермент, гомологичный GDP-манноза 4,6-дегидратазе, который участвует в синтезе GDP-фукозы. Инъекция GDP-фукозы в клетки кишечника C. elegans спасает фенотип bre-1 . Эти мутанты также обнаруживают дефекты в продукции полярных гликолипидов, которые действуют как рецепторы для Cry5B (Griffiths et al., 2005). Эти углеводы содержат ядро ​​артроза, которое присутствует у нематод, но отсутствует у позвоночных (Hu and Aroian, 2012b). Мономеры белка Cry связываются с рецепторами кишечных клеток, олигомеризуются и проникают в плазматическую мембрану с образованием пор. Эти отверстия в мембране нарушают целостность клетки, ионный баланс и мембранные потенциалы, что приводит к гибели или серьезному нарушению клеточной активности. На данный момент все протестированные нематоды, независимо от того, являются ли они свободноживущими паразитами животных или растений, чувствительны к Cry5B.В интересном исследовании было показано, что комбинированная терапия агонистами Cry5B и nAChR может иметь потенциал, поскольку комбинация проявляет синергетические свойства (Hu et al., 2010). В C. elegans путь митоген-активируемой протеинкиназы p38 (MAPK) защищает от Cry5B (Kao et al., 2011). Аналогичная ситуация была обнаружена у нематод, например, A. ceylanicum (Hu et al., 2012a), демонстрируя, что C. elegans , вероятно, будет хорошей моделью для изучения этих токсинов у нематод.

4.11. Фосфаторганические и карбаматные антихолинэстеразы: дихлофос, галоксон, трихлорфон и алдикарб

Антихолинэстеразы блокируют ферменты, расщепляющие нейромедиатор ацетилхолин. Таким образом, введение соединений приводит к повышению синаптических уровней ацетихолина в нервно-мышечном соединении у нематод и приводит к спастическому параличу. Однако эти соединения очень токсичны для всех организмов, которые используют ацетилхолин в качестве нейромедиатора, включая людей, и это серьезно ограничивает их использование.Они использовались в качестве нематицидов против нематод, паразитирующих на растениях, но из-за их токсичности в настоящее время они перестают использоваться даже в качестве химических средств борьбы с растениями из-за серьезных экологических проблем. Здесь мы кратко обсудим исследование этих соединений в C. elegans и выделим возможные области для будущих улучшений.

Органофосфаты и карбаматы, действующие посредством фосфорилирования и карбамилирования активного центра фермента, соответственно, были основными ингибиторами холинэстеразы, используемыми в качестве глистогонных средств (Selkirk et al., 2005). В целом органофосфаты не являются селективными по отношению к холинэстеразам нематод, поэтому имеют низкий терапевтический индекс и в значительной степени заменены глистогонными средствами, менее токсичными для хозяина. Однако в недавних исследованиях пиридиновых соединений как потенциальных противогельминтных средств одно соединение, диэтил-2,2 ‘- [(3-нитропиридин-2,6-диил) бисульфандиил] диацетат, которое было эффективным в качестве антихолинэстеразного глистогонного средства, не было токсичным для крысам в дозе 2000 мг / кг (Valli et al., 2011). Следовательно, пиридиновые соединения вместе с пиразинами могут обеспечить в будущем более безопасные ингибиторы холинэстеразы с высокими терапевтическими индексами.

Холинэстеразы широко распространены у животных, включая нематод, и были подробно изучены на C. elegans . Восемнадцать генов устойчивости к алдикарбу и трихлорфону были охарактеризованы у C. elegans (Nguyen et al., 1995). К ним относятся cha-1, ric-1, -3, -4, snt-1 (ric-2) и десять мутантов unc . Впоследствии четыре различных гена ацетилхолинэстеразы, viz, ace-1 (класс A), ace-2 (класс B), ace-3 (класс C) и ace-4 были идентифицированы в . С.elegans (Grauso et al., 1998). Паттерны экспрессии этих генов были исследованы Combes et al. (2003). ace-1, экспрессируется во всех мышечных клетках стенки тела и вульвы, ace-2 в нейронах (включая амфидный нейрон AWC), ace-3; ace-4 оперон в мышечных клетках глотки, pm3, pm4, pm5 и pm7, некоторых нейронах головы и ганглия, а также в CAN. Интересно, что клетки глотки pm5 экспрессируют ace-1, ace-2, и ace-3 , но в остальном эти гены имеют свои собственные паттерны экспрессии, что указывает на отсутствие избыточности.

В нескольких работах исследовалось влияние органофосфатов на экспрессию генов у C. elegans (Lewis et al., 2013; Vinuela et al., 2010; Jadhav and Rajini, 2009; Lewis et al., 2009). Используя сублетальную концентрацию дихлофоса, 5–80 мкМ и четырехчасовую экспозицию, Jadhav и Rajini (2009) обнаружили, что глоточная помпа и активность ацетилхолинэстеразы были ингибированы. LD ₅₀ для дихлофоса снизилась при увеличении времени воздействия с 4 до 36 часов. При воздействии 5–80 мкМ дихлофоса в течение 4–3 часов индукция белка теплового шока, hsp-16 , увеличивалась как с концентрацией, так и со временем, с максимумом через 24 часа, а затем индукция снижалась.Индукция hsp-16 ограничивалась глоткой. Эти исследования показали, что сублетальные концентрации органофосфата могут влиять на питание, активность ацетилхолинэстеразы и экспрессию стрессового гена. Индукция hsp-16 в C. elegans использовалась в качестве монитора стресса окружающей среды (Stringham and Candido, 1994). В своем исследовании Vinuela et al. (2010) подвергали яиц C. elegans в течение 72 часов воздействию хлорпирифоса (0,5 мг / л, прибл.4 мкМ) или диазинон (1,0 мг / л, примерно 3,3 мкМ) или смесь двух органофосфатов. Они обнаружили, что 551 ген регулируется хлорпирифосом, 245 — диазиноном, а 126 — любым соединением. 233 гена регулировались смесью, включая 89 генов, которые не регулировались только соединениями. Интересно, что хотя структуры двух органофосфатов схожи, многие из индуцированных ими генов различны. Эти гены участвуют в ряде путей, связанных с детоксикацией (включая фазы I и II метаболизма ксенобиотиков), стрессом, врожденным иммунитетом, а также транспортом и метаболизмом липидов.Vinuela et al. (2010) отметили, что, хотя эффекты на экспрессию генов смеси двух органофосфатов показали отличия от эффектов отдельных соединений, затронутые пути были сходными, включая daf-16, elt-2, snk1 / pmk-1, и sma-9 . В своей первой статье Lewis et al. (2009) подвергали стадию L4 C. elegans воздействию органофосфатов дихлофос (3–50 мг / л, примерно 13,5–226 мкМ) или фенамифоса (10–200 мг / л, примерно 33–660 мкМ) или противомалярийный мефлохин (26–1300 мкМ) (в качестве контроля) в течение 8 часов.На экспрессию 87 генов повлияло воздействие органофосфатов, но не мефлохина, в то время как количество 34 белков также изменилось. Многие из этих генов и белков экспрессируются в мышечной и нервной ткани и играют роль в метаболизме липидов, клеточной адгезии, апоптозе и детоксикации. Как и в исследовании Vinuela et al. (2010), некоторые из генов, экспрессия которых была изменена, были селективными в отношении того или иного органофосфата. Во второй статье Lewis et al. (2013) первоначально исследовали влияние диапазона концентраций (0.12-15,0 мкМ) дихлофоса при поведении C. elegans . 0,6 мкМ и 15,0 мкМ были выбраны для исследования экспрессии генов, и животные L3 / L4 подвергались воздействию в течение 2 или 8 ч или непрерывно в течение эксперимента. Большое количество генов, экспрессируемых после воздействия дихлофоса, транскрипционно регулируется DAF-16, который связан с контролем метаболизма, старения, врожденного иммунитета и стрессовых реакций у C. elegans . Дихлофос активировал гены, аналогичные активированным при бактериальных инфекциях у C.elegans, , которые участвуют в врожденном иммунитете. Дихлофос также активировал гены, необходимые для миогенеза, регенерации аксонов ( dlk-1 и pmk-3 ) и управления. Гены, связанные с иммунным ответом и энергетическим метаболизмом, активировались в течение 2 часов. Lewis et al. (2013) также искали гены, участвующие в восстановлении от дихлофоса, и идентифицировали T19C4.5 и hsp-16.41, , которые экспрессировались после удаления дихлофоса. Было идентифицировано семь ключевых генов, которые активируются дихлофосом; unc-43, tir-1, sek-1, flp-18, sma-4, sma-6, и ins-7 .Они пришли к выводу, что основными механизмами действия дихлофоса являются ингибирование ацетилхолинэстеразы и истощение запасов энергии, возможно, из-за митохондриальной дисфункции. Однако из этих исследований ясно, что, помимо манипулирования уровнями ацетилхолина, органофосфаты могут действовать на ряд физиологических процессов у C. elegans, и, по аналогии, также у паразитических нематод.

4.12. Флавоноиды: апигенин

C. elegans использовался для скрининга флавоноидов на антигельминтную активность.В исследовании с участием 13 флавонов было обнаружено, что апигенин подавляет рост личинок (Yoon et al., 2006). Когда первое поколение развивалось в присутствии апигенина, наблюдалось небольшое уменьшение размеров тела, но развитие личинок в поколении F1 было сильно нарушено в присутствии флавона. Механизм, связанный с этим ингибированием роста личинок у C. elegans , был исследован Kawasaki et al. (2010) и было обнаружено, что он связан с активацией DAF-16. Эти авторы предположили, что апигенин действует как стрессор, либо напрямую стимулируя активность DAF-16, либо ингибируя передачу сигналов DAF-2 / инсулин, что снижает ингибирующий эффект DAF-2 на DAF-16.В любом случае активируется DAF-16, что приводит к аресту личинок. Было показано, что флавон (2-фенилхромон) вызывает гибель эмбрионов и личинок как у C. elegans , так и у паразитической нематоды растений, сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus (Lee et al., 2008).

4.13. Фторалкенилы: флуенсульфон

Флуенсульфон (5-хлор-2- (3,4,4-трифторбут-3-енилсульфонил) -1,3-тиазол) входит в группу фторалкенилтиоэфиров и доказал свою способность в качестве нового нематицида для борьба с паразитарными нематодными инфекциями растений (Oka et al., 2012; Ока и др., 2009). Например, было показано, что применение флуенсульфона как при орошении почвы, так и при опрыскивании листвы значительно снижает корневую инфекцию и проникновение нематод, паразитирующих на растениях, Meloidogyne javanica (Oka et al., 2009) и M. incognita (Oka et al. ., 2012). Флуенсульфон оказывает заметное влияние на развитие и поведение C. elegans , и профиль его эффектов отличается от других основных классов глистогонных и нематоцидов, включая левамизол, ивермектин и органофосфаты, что предполагает особый механизм действия (Kearn et al. al., 2014).

4.14. Спироиндолины: SYN351, SYN876

Спироиндолины обладают как инсектицидной, так и глистогонной активностью, при этом SYN351 является ведущим соединением для исследований с использованием C. elegans (Sluder et al., 2012). SYN351 вызывает нескоординированную «петлевую», изгибающуюся локомоцию у C. elegans, , а также подавляет частоту глоточной перекачки. cha-1 Мутанты , которые имеют дефект в их способности синтезировать ацетилхолин, являются гиперчувствительными в присутствии спироиндолина SYN876, в то время как сублетальные дозы SYN876 подавляют эффект ингибитора холинэстеразы альдикарба.Эти эксперименты показывают, что спироиндолины оказывают влияние на поведение нематод, эффективно снижая уровни доступного ацетилхолина в синапсе. Скрининг химического мутагенеза с использованием C. elegans дал мутанты, устойчивые к спироиндолинам. Эти устойчивые штаммы несли мутации в гене, кодирующем везикулярный переносчик ацетилхолина (VAChT), unc-17 (Sluder et al., 2012), что свидетельствует о том, что UNC-17 может быть мишенью для соединения.Дальнейшие исследования, в которых везикулярный переносчик ацетилхолина из Drosophila экспрессировался в клетках PC12, продемонстрировали сайт связывания спироиндолина, который может быть замещен классическим ингибитором везикулярного транспорта ацетилхолина везамиколом. Взятые вместе, эти данные согласуются с предположением, что мутации в unc-17 придают C. elegans устойчивость к спироиндолинам. Следовательно, спироиндолины представляют собой группу соединений, которые, по-видимому, нацелены на новый сайт антигельминтного действия, а именно на везикулярный переносчик ацетилхолина (Sluder et al., 2012).

5. Будущее

Особой проблемой для компаний, занимающихся исследованиями противогельминтных средств и нематицидов, не имеющих такого опыта в фармацевтической промышленности, является то, что рентабельность является главной задачей. Более того, существуют дополнительные ограничения в отношении допустимых уровней токсичности для хозяина. Например, в тропической медицине глистогонные средства необходимо использовать в программах массовой химиотерапии в регионах, где клиническая поддержка недостаточна, и, следовательно, лекарства должны очень хорошо переноситься людьми всех возрастов.При обработке домашнего скота стойкость химических веществ в тканях становится проблемой для производства мяса, в то время как при использовании нематицидов для защиты растений необходимо тщательно учитывать стабильность, вымывание из почвы и токсичность для окружающей среды, особенно воздействие на нецелевые организмы.

Как видно из приведенного выше обсуждения, в настоящее время для удовлетворения этих потребностей доступен лишь относительно небольшой набор лекарств и химикатов. Примечательно, что ивермектин оказался чрезвычайно успешным как в ветеринарии, так и в тропической медицине, а его использование в Африке изменило жизнь людей, ранее пострадавших от тропической болезни онхоцеркоз (речная слепота).Однако в последние пять лет появилась устойчивость к ивермектину (Osei-Atweneboana et al., 2011), и весьма вероятно, что скоро потребуются преемники для этого чрезвычайно важного глистогонного средства.

Недавно был достигнут прогресс в разработке лекарств и химических веществ для борьбы с паразитическими нематодами. С 2007 года три новых глистогонных средства были использованы в рецептурах коммерчески доступных препаратов; эмодепсид (Profender ^® для кошек и таблетки для собак, Procox ^® для щенков), монепантел (Zolvix ^® для овец) и деркуантел (Starect ^® для овец).Еще неизвестно, могут ли эти антигельминтные препараты использоваться в составах для борьбы с дальнейшими паразитарными нематодными инфекциями домашнего скота и людей, и действительно ли они обладают эффективностью или предоставляют новые возможности для решения проблемы нематод, паразитирующих на растениях. Введение этих глистогонных средств и их ограниченное использование в настоящее время было недавно кратко обсуждено Epe и Kaminsky (2013). Эмодепсид эффективен против филяриатных нематод, и соединения этого класса могут оказаться полезными в будущем для лечения филяриоза (Olliaro et al., 2011; Zahner et al., 2001). В разработке есть и другие возможности. Например, клозантел (салициланилид) потенциально может лечить онхоцеркоз (Gloeckner et al., 2010). Клозантел является ингибитором филяриальной хитиназы, которая приводит к подавлению линьки у инфекционных личинок L3 Onchocerca volvulus . Однако на этой стадии паразит присутствует в организме хозяина лишь ненадолго, и, кроме того, клозантел действует как протонофор и разобщитель окислительного фосфорилирования (Skuce and Fairweather, 1990), что может ограничивать полезность этого соединения.Тем не менее, ряд аналогов клозантела также был синтезирован и протестирован на активность на O. volvulus (Garner et al., 2011).

Как мы отмечали в этом обзоре, C. elegans сыграл важную роль в определении способа действия антигельминтиков и нематоцидов, а также может способствовать пониманию механизмов устойчивости, особенно за счет принятия «прыгающей модели». ‘подход, при котором функциональность генов паразитов оценивается с использованием C.elegans как экспрессионная система. Полезности этого подхода будет способствовать прогресс в секвенировании и характеристике геномов паразитов. В этом отношении следует отметить недавнюю публикацию проекта генома MHCO3 (ISE) .N1, инбредного штамма H. contortus , чувствительного ко всем основным глистогонным средствам, и его сравнение с геномом C. elegans ( Laing et al., 2013). Пентамерные лиганд-зависимые ионные каналы у H. contortus очень похожи на таковые у C.elegans , предполагая ценность C. elegans в качестве модели нервной системы нематод Strongylid. Однако существуют важные различия в генах в отношении передачи сигналов глутамата, ацетилхолина и амина. Laing et al. (2013) последовала вторая статья о геноме и онтогенетическом транскриптоме H. contortus (Schwarz et al., 2013).

Интересным продолжением подхода к модели прыгающего типа является разработка вакцин против паразитических нематод, в которых C.elegans можно использовать для экспрессии вакцинных антигенов (Knox, 2012; Murray et al., 2007).

Вероятно, важное значение для будущего имеет использование C. elegans в качестве модельной системы для открытия лекарств. Остается надеяться, что это предоставит новые антигельминтные средства с новыми механизмами действия и, таким образом, позволит обойти проблему устойчивости к глистогонам. Комбинация РНКи и высокопроизводительных методов анализа C. elegans стимулировала интерес к открытию лекарств с использованием химических генетических скринингов (Behm et al., 2005; Jones et al., 2005). Достижения в применении микрофлюидных и капельных подходов к изучению C. elegans, и включение оптогенетики расширили эту возможность; были разработаны различные «чипы», которые облегчают визуализацию, поведенческий анализ и электрофизиологию (Hu et al., 2013; Kearn et al., 2013; Liu et al., 2013; Lockery et al., 2012; Xu and Kim , 2011; Stirman et al., 2010; Ben-Yakar et al., 2009; Hulme et al., 2008; Chronis et al., 2007).Молекулярные мишени для лекарств, которые поступают из этих экранов или из других конвейеров, могут быть определены с использованием мощного подхода прямой генетики в C. elegans, и могут открыть новые эффекторы антигельминтного действия.

Также продолжаются более целенаправленные подходы к открытию противогельминтных препаратов. Они предоставляют фундаментальную информацию по нейробиологии нематод с целью идентификации сигнальных молекул, которые играют ключевую роль в нервных цепях, которые лежат в основе жизненного поведения.В этом контексте нервная система нематод все еще имеет сайты-мишени, такие как ионные каналы и рецепторы, которые еще не использовались и могут лечь в основу новых глистогонных средств (Wolstenholme, 2011). Будет интересно посмотреть, трансформируется ли стремление нацелить пептидергические сигнальные пути в рыночный препарат (Geary and Maule, 2010; Greenwood et al., 2005), хотя промышленность активно исследует характеристики рецепторов FLP из C . elegans (Ларсен и др., 2013). Однако до настоящего времени успехов не было (Geary, 2012; McVeigh et al., 2012). Также существует множество ферментов, участвующих в сигнальных и метаболических путях, которые могут обеспечивать новые участки для антигельминтного действия, вместе с рецепторами нематод амина (Rana and Misra-Bhattacharya, 2013; Geary, 2012).

В заключение, как обсуждалось здесь и дополнительно подчеркивалось в других источниках (Epe and Kaminsky, 2013; Olliaro et al., 2011), существует острая необходимость в разработке новых глистогонных средств ввиду растущей угрозы для скота и человека со стороны глистогонных средств. -резистентные штаммы паразитов. C. elegans оказался чрезвычайно полезным модельным организмом для изучения способов действия, однако возможность, которую он предоставляет для открытия лекарств, вероятно, использовалась недостаточно (см. «Преодоление разрыва»; Бюллетень заводчиков червей, том 19, номер 4). Дополнительную озабоченность вызывает опасность для сельскохозяйственных культур нематод, паразитирующих на растениях, поскольку доступные в настоящее время нематоциды постепенно прекращаются из-за их воздействия на окружающую среду. В будущем исследование C. elegans должно быть применено к решению этих важных задач для медицины и ветеринарии, а также для обеспечения продовольственной безопасности.

Благодарности: мы благодарны двум анонимным рецензентам за полезные комментарии, которые улучшили эту рукопись.

The WBG — служба электронных публикаций WormBook

Wadim J. Kapulkin ^{1, 2, 3}

1 Отделение вирусологии и иммунопатологии, Национальный институт общественного здравоохранения-PZH, Chocimska 24, 00-791 Варшава, Польша
2 Отделение инфекционных болезней, микробиологии и паразитологии, факультет ветеринарной медицины, Grochowska 272, 03-849 Варшава, Польша
3 || Нынешний адрес: Veterinary Consultancy, Conrada 01-922, Варшава, Польша

.

РНК-интерференция (Fire et al.1998) — популярная стратегия скрининга «обратной генетики». В частности, проглоченный вариант РНКи (Timmons et al. 1999) приобрел популярность для скрининга всего генома, где бактериально экспрессируемая дцРНК вводится per os с использованием модифицированных плазмид и E. coli в качестве питающего вектора (Timmons et al. 2001 ). Полногеномный скрининг РНКи в настоящее время осуществляется с использованием библиотек для кормления РНКи.

В настоящее время доступны два типа «питающих библиотек» РНКи по всему геному, включающих в себя ПЦР-амплифицированные целевые области: библиотека предсказанных перекрывающихся сегментов генов (Kamath et al.2003) и амплифицированную библиотеку кДНК (Rual et al. 2004). Однако доступные библиотеки рекомбинантных РНКи на основе ПЦР по всему геному — ресурсы, состоящие из плазмид, продуцирующих дцРНК, — в значительной степени зависят от предсказаний генов, отсюда и смещение в сторону определенных богатых экзонами участков генов или определенных кДНК. Здесь я сообщаю о дополнительном ресурсе, способствующем подходу к скринингу РНКи, основанному на беспристрастной стратегии «прямой генетики».

Эксперименты, основанные на этом подходе, начались с конструирования библиотеки геномных сегментов, включенных в вектор конвергентной плазмиды сайтов связывания полимеразы Т7 (PBS) (плазмида L4440), который был лигирован со стандартной мелкомасштабной жидкой ДНК червя, предварительно расщепленной с помощью EcoRI . и HindIII * и преобразован в HT115 (DE3) E.coli (Тиммонс и др., 2001). Полученная конвергентная библиотека T7 PBS была оценена как ~ 95% рекомбинантная. Конвергентные клоны библиотеки Т7 скармливались индивидуально по стандартному протоколу (как описано ранее, Kapulkin et al. 2005) червям, полученным из N2, для подтверждения очевидного летального / стерильного фенотипа, встречающегося с частотой 1-2 на 24 протестированных клона.

Основываясь на вышеупомянутом эксперименте, я считаю, что прямой скрининг РНК-интерференции полезен и осуществим, с сильным ожиданием, что представленный режим скрининга дополнит и расширит существующие, доступные в настоящее время, общегеномные ресурсы РНКи.

* Другие варианты эксперимента, исследованные в другом месте, включают фрагментированную ДНК, лигированную с другими ферментами и / или линкерами .

Список литературы

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Сильная и специфическая генетическая интерференция двухцепочечной РНК у Caenorhabditis elegans. Природа. 1998 19 февраля; 391 (6669): 806-11.

Kamath RS, Fraser AG, Dong Y, Poulin G, Durbin R, Gotta M, Kanapin A, Le Bot N, Moreno S, Sohrmann M, Welchman DP, Zipperlen P, Ahringer J.Систематический функциональный анализ генома Caenorhabditis elegans с использованием РНКи. Природа. 2003 16 января; 421 (6920): 231-7.

Капулкин В.Дж., Hiester BG, Ссылка CD. Компенсаторная регуляция среди шаперонов ER у C. elegans. FEBS Lett. 6 июня 2005 г .; 579 (14): 3063-8. Ошибка в: FEBS Lett. 2007 22 декабря; 581 (30): 5952. Капулкин, Вадим [исправлено на Капулкина, Вадима Дж.].

Rual JF, Ceron J, Koreth J, Hao T, Nicot AS, Hirozane-Kishikawa T., Vandenhaute J, Orkin SH, Hill DE, van den Heuvel S, Vidal M.На пути к улучшению картирования феномена Caenorhabditis elegans с помощью библиотеки РНКи на основе ORFeome. Genome Res. 2004 Октябрь; 14 (10B): 2162-8.

Timmons L, Court DL, Fire A. Проглатывание экспрессируемых бактериями дцРНК может вызвать специфическое и сильное генетическое вмешательство в Caenorhabditis elegans. Ген. 2001 24 января; 263 (1-2): 103-12.

Timmons L, Fire A. Специфическое вмешательство со стороны проглоченной дцРНК. Природа. 1998 29 октября; 395 (6705): 854.

Открытие антигельминтных препаратов: идентификация целей, методы скрининга и роль открытой науки

Необходимость открытия глистогонных препаратов

Противогельминтные препараты — это собирательный термин для группы препаратов, предназначенных для лечения инфекций животных или людей, инфицированных паразитическими червями (гельминтами).Паразитические черви заражают широкий спектр видов и как таковые представляют собой серьезное бремя не только для здоровья человека, но и для животноводства и растениеводства. Существует два основных типа гельминтов — нематоды (также известные как круглые черви) и платигельминты (также известные как плоские черви). К нематодам относятся человеческие гельминты, передающиеся через почву, например, Ascaris lumbricoides , и переносимые переносчиками тканевые филяриальные черви, например, Wuchereria bancrofti , в то время как платигельминты включают трематоды (также известные как сосальщики) e.грамм. Schistosoma mansoni и цестоды (также известные как ленточные черви), например, Taenia solium .

Хотя в текущем обзоре основное внимание уделяется неудовлетворенной потребности в открытии противогельминтных препаратов для борьбы с бременем гельминтозов человека, заражение домашнего скота паразитическими червями имеет важные последствия для благополучия животных и может привести к значительным экономическим потерям для животноводческой отрасли.В промышленно развитых странах большинству домашнего скота обычно дают глистогонки для контроля или предотвращения инфекций, и, по оценкам, ежегодно проходят лечение сотни миллионов овец, коз и крупного рогатого скота [1]. Лечение лошадей, других непарнокопытных и домашних животных также является основным применением глистогонных средств.

Открытие антигельминтных лекарств было постоянным приоритетом в индустрии здоровья животных, чему способствовало распространение устойчивости к макроциклическим лактонам [2].За последние 25 лет на рынок вышли три новых класса глистогонных препаратов: деркуантел, эмодепсид и монепантел. Однако продолжающееся появление устойчивости к глистогонам в сочетании с менее предсказуемыми схемами заражения из-за изменений климата привело к нарушению контроля над этими паразитами [3].

Человеческие гельминтозы относятся к забытым тропическим болезням (NTD).Наиболее частые инфекции, которые мы выделим в этом обзоре, вызываются гельминтами, передаваемыми через почву (ППГ), шистосомами и лимфатическими филяриатными червями (таблица 1). Эти инфекции в основном распространены в сельских, бедных районах тропических и субтропических регионов развивающегося мира, и часто встречаются сочетанные инфекции несколькими различными гельминтами [4]. Как правило, гельминтозы связаны с заболеваемостью (см. Таблицу 1), а не со смертностью, а инфекции высокой интенсивности связаны с повышенной заболеваемостью.В совокупности они представляют собой огромное глобальное бремя, которое оценивается в 6,4 миллиона лет жизни с поправкой на инвалидность (DALY) [5], с последствиями для всей жизни, поскольку они ограничивают образовательные перспективы детей и снижают производительность труда [6,7]. Таким образом, они фактически загоняют в ловушку бедности целые страны.

Таблица 1: Распространенность и заболеваемость основными гельминтозными инфекциями человека.DALY — это годы жизни с поправкой на инвалидность.

болезнь	основной этиологический гельминт	число зараженных (млн)	DALYs (миллион)	заболеваемость
гельминты, передающиеся через почву
аскаридоз	Аскарида пояснично-крестцовый	819 [8,9]	1.3 [5]	инфекции (отчасти из-за размера и количества гельминтов) и кишечные непроходимости (потенциально требующие хирургического вмешательства) , задержка роста и влияние на когнитивные функции [10–12].
анкилостомоз	Necator americanus; Дуоденальная анкилостома	439 [8,9]	1.7 [5]	анемия, которая может вызвать осложнения во время беременности и после родов; задержка роста и влияние на познание [13,14].
трихоцефалопатия	Trichuris trichiura	465 [8,9]	0.3 [5]	воспалительные очаги и кровотечения, задержка роста и влияние на познание [15-17].
филяриальные нематоды
лимфатический филяриатоз	Wuchereria bancroft; Brugia malayi	120 [18]	1.2 [5]	лимфедема (слоновость), гидроцеле, почечная патология, проявляющаяся в виде хилурии, и острый дерматолимфангиоаденит, вызывающие регулярные лихорадки.
онхоцеркоз	Onchocerca volvulus	20 [19]	1.0 [5]	зуд, воспаление кожи и нарушение зрения или слепота
Платигельминтовые трематоды
шистосомоз	Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum	Более 250 [20]	1.9 [5]	острая инфекция: миалгия, боли в животе в правом подреберье, диарея, утомляемость, недомогание, лихорадка, хроническая инфекция: реакции против яиц, задержанных в тканях хозяина, приводят к воспалительным и обструктивным симптомам; пораженные ткани и органы зависят от Schistosoma spp. шистосомоз также связан с недостаточным питанием, непереносимостью физических упражнений, диареей (иногда с кровью), хронической болью и анемией [20].

Современные глистогонные средства — СТГ

Гельминтозы преимущественно локализуются в невидимых сельских районах стран с низким уровнем дохода; таким образом, несмотря на их распространенность, они были названы «забытыми болезнями забытых людей» [21]. Возможно, поэтому неудивительно, что почти все лекарства, доступные для лечения людей, изначально были разработаны как ветеринарные.

Эффективные и безопасные антигельминтные препараты могут снизить распространенность, интенсивность и заболеваемость, связанные с ППГ. Существуют две основные стратегии доставки: ведение пациентов с диагностированным диагнозом и профилактическая химиотерапия, основанная на массовом введении однократной дозы для недиагностированных лиц; иначе известное как массовое введение лекарств (МДА) [22-24].Программы MDA являются краеугольным камнем стратегии борьбы с этими инфекциями и обычно нацелены на лечение детей дошкольного возраста или посещающих школу.

В настоящее время Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует ежегодное или двухгодичное (при исходной распространенности более 50%) вмешательство глистогонных средств альбендазола (ALB, 1 ) или мебендазола (MEB, 2 ) для лечения ППГ [25 , 26].При достижении показателей излечения, приближающихся к 100% для аскарид, эти препараты при использовании в качестве монотерапии в виде однократных доз менее эффективны против анкилостомоза [27,28] и имеют шокирующе низкие показатели излечения и уменьшения количества яиц против T. trichiura [29]. (Важно отметить, что эти препараты действительно имеют гораздо лучшую эффективность при введении в качестве курса лечения. Однако, учитывая практичность и огромный масштаб программ массового введения лекарств, эффективность однократной дозы является эталоном для MDA.) В результате, Комбинированная терапия с однократной дозой, например, тетрагидропиримидинпирантела памоатом (PYP, 3 ) и оксантела памоатом (OXP, 4 ), в последние годы с некоторым успехом пропагандировалась (таблица 2, рисунок 1) [30].

Рисунок 1: Состав некоторых современных передовых антигельминтных средств, обсуждаемых в обзоре. * Обозначает стереогенный центр: празиквантел вводят в виде рацемической смеси.

Рисунок 1: Состав некоторых современных передовых антигельминтных средств, обсуждаемых в обзоре.* Обозначает стереогр …

Таблица 2: Комбинации лекарств показывают повышенную эффективность однократного излечения гельминтов, передаваемых через почву. CR: показатель излечения — доля инфицированных людей, у которых после лечения указанным лекарственным средством (-ами) наблюдается отрицательный результат.ERR: скорость уменьшения количества яиц — уменьшение количества яиц после обработки, выраженное как доля от количества яиц до лечения. Данные из [30].

	MEB ( 1 )		ALB ( 2 )		ALB ( 2 ) + PYP ( 3 ) + OXP ( 4 )		MEB ( 1 ) + PYP ( 3 ) + OXP ( 4 )
	CR	ERR	CR	ERR	CR	ERR	CR	ERR
Аскарида поясничная	96.8	99,5	96,5	99,7	90,4	98.3	100,0	100,0
Necator americanus и Ancylostoma duodenale	41.6	65,1	78,5	92,1	92,8	96.7	84,7	93,4
Trichuris trichiura	44,4	80.7	32,1	64,3	84,2	92,7	75.2	90,7

К сожалению, лекарственная устойчивость к бензимидазолам 1 и 2 и другим глистогонным средствам была обнаружена у ветеринарных паразитов с мутациями в гене бета-тубулина [31,32]. На сегодняшний день имеется ограниченное количество данных о резистентности к бензимидазолам у человеческих СТГ [33], хотя аллели резистентности к бензимидазолу обнаруживаются с повышенной частотой после антигельминтного лечения [34,35].Однако по мере того, как использование этих глистогонных средств увеличилось за последнее десятилетие, благодаря пожертвованию миллионов доз этих препаратов для обеспечения массового применения лекарств, селективное давление на ГПГ увеличилось. Это могло спровоцировать появление лекарственной устойчивости [36]. Кроме того, наземная стадия СТГ может сохраняться в виде яиц в почве в течение нескольких месяцев ( A. lumbricoides и T. trichiura ), а личинки — несколько недель (анкилостомы), в зависимости от преобладающих условий окружающей среды [37].Этот экологический пул инфекционной стадии жизненного цикла подвергает риску повторного заражения даже тех, кто успешно лечится по схемам MDA [38]. Поэтому было высказано предположение, что, помимо улучшения санитарных условий для решения этой проблемы, действующий на окружающую среду агент, воздействующий на яйца, мог бы играть дополнительную роль в предотвращении передачи [39]. ВОЗ поставила глобальную цель по ликвидации заболеваемости среди детей гельминтозами, передаваемыми через почву, к 2020 году путем регулярного лечения не менее 75% детей в эндемичных районах (общее число которых оценивается в 873 миллиона) [40].Маловероятно, что эта цель будет достигнута, поэтому срочно необходима разработка новых мощных антигельминтных препаратов, которые действуют через новые механизмы действия.

Современные глистогонные средства — шистосомоз

празиквантел (PZQ, 5 ), N -ацилированное производное тетрагидроизохинолин-пиперазинона, было основой лечения шистосомоза более 30 лет [20].PZQ в настоящее время вводят в виде рацемической смеси (рис. 1), несмотря на то, что ( R ) -энантиомер является биологически активной формой [41]. Как будет обсуждаться позже в этом обзоре, удалось получить активные частицы в энантиомерно чистой форме. Завершено клиническое исследование биодоступности перорально диспергируемых таблеток левопразиквантела [42], и в настоящее время проводится исследование фазы III по оценке безопасности и эффективности (NCT03845140).

Oral PZQ безопасен и эффективен против взрослых глистов всех Schistosoma spp., хотя только совсем недавно появились указания на механизм его действия [43]. PZQ является основой глобальных программ борьбы с шистосомозом на уровне сообществ, которые используют MDA для снижения заболеваемости. Метаанализ показал, что рекомендованная ВОЗ доза PZQ (40 мг / кг) обеспечивает уровень излечения (CR) между 76–95% для различных видов Schistosoma и 63,5% для смешанных S. haematobium и S. .mansoni и средний уровень снижения яиц (ERR) между 86–95% [44].

Однако, хотя PZQ безопасен и эффективен против взрослых глистов, его назначают только один раз, и, поскольку препарат не действует против стадии мигрирующей шистосомулы паразита, если эти личинки присутствуют, возникнет новая инфекция. Более того, PZQ не предотвращает повторное инфицирование, и поэтому передача может быстро возобновиться только от нескольких инфицированных пациентов, которые могут загрязнить водную среду.

Кроме того, возникновение лекарственной устойчивости вызывает беспокойство в связи с некоторыми сообщениями об инфекциях, которые плохо реагируют на PZQ в регионах, где исторически широко использовался этот препарат [45]. Однако, как и в случае с бензимидазолами, нет четкого подтверждения развития клинически значимой устойчивости к празиквантелу [46]. Тем не менее, существует широко распространенное беспокойство по поводу риска, связанного с использованием одного препарата, особенно в связи с дальнейшим расширением масштабов использования MDA, когда ежегодно предоставляются сотни миллионов доз празиквантела [20].Еще одно неизвестное влияние на будущее лечения шистосомоза — это влияние, которое изменение климата может оказать на водную среду (и промежуточного хозяина пресноводной улитки Biomphalaria glabrata) и, следовательно, на распространение болезней, передающихся через воду, таких как шистосомоз [47].

Как и в случае с ЗПЗ, целью ВОЗ по шистосомозу на 2020 год является контроль заболеваемости за счет снижения распространенности инфекций высокой интенсивности до менее 5% среди детей школьного возраста.Однако, несмотря на то, что эти руководящие принципы могут быть выполнены в регионах с более низкой распространенностью на основе действующих руководств ВОЗ по MDA, существует малая вероятность того, что эти цели будут достигнуты в регионах с высокой распространенностью, где потенциал передачи выше [48].

Современные глистогонные средства — лимфатический филяриатоз

Лечение лимфатического филяриоза (ЛФ) контролируется Глобальной программой ВОЗ по ликвидации лимфатического филяриоза (GPELF), которая была запущена в 2000 году.Для достижения цели ВОЗ по устранению LF как проблемы общественного здравоохранения, GPELF использует двусторонний подход, включающий не только профилактическую химиотерапию с использованием MDA для лечения группы риска, тем самым прерывая передачу, но также и управление заболеваемостью.

К 2018 году GPELF предоставил более семи миллиардов процедур более чем 910 миллионам человек [49].Четырнадцать стран устранили LF как проблему общественного здравоохранения, и еще десять стран смогли остановить MDA благодаря прогрессу в борьбе с инфекцией.

MDA для LF включает комбинации трех глистогонных средств — альбендазола (ALB, 1 ), цитрата диэтилкарбамазина (DEC, 6 ), ивермектина (IVE, 7 , вводимого в виде смеси B _1a и B _1b. ).Недавнее исследование показало, что однократная доза тройной терапии (IVE + DEC + ALB) способна вывести W. bancrofti микрофилярий из крови в течение трех лет почти у всех пациентов, получавших лечение, и это превосходило однократную дозу терапия двумя лекарствами (DEC + ALB) и не ниже трех годовых доз терапии двумя препаратами [50]. Это исследование также предоставило доказательства того, что, помимо устранения микрофилярий, как двойные, так и тройные лекарственные препараты обладают частичным макрофилярицидным действием, что измеряется снижением уровней циркулирующих филяриатных антигенов.Второе испытание также показало, что однократная доза терапии тремя препаратами (IVE + DEC + ALB) имела большую способность уменьшать микрофилярии на W. bancrofti в течение 24 месяцев после лечения по сравнению с ежегодным приемом двух препаратов (IVE + ALB). ) терапии [51], хотя микрофиляриальный клиренс не был устойчивым в популяции, проходящей лечение, вероятно, из-за повторного инфицирования. Важно отметить, что это исследование также обнаружило большую инактивацию гнезд взрослых червей (скопления активных взрослых червей в лимфатической ткани) в группе IVE + DEC + ALB, демонстрируя макрофилярицидный эффект этой комбинации лечения.

Эти и другие исследования привели к тому, что ВОЗ рекомендовала тройную терапию (IVE + DEC + ALB) для MDA в странах, где нет эндемического онхоцеркоза или лоаза [52]. Внедрение тройной терапии MDA имеет большие перспективы для устранения LF во многих странах.

К сожалению, в странах, где онхоцеркоз является эндемическим, DEC ( 5 ) противопоказан, и достижение излечения особенно проблематично в регионах, где дополнительно Loa loa является ко-эндемичным, и поэтому использование IVE ( 7 ) противопоказано. .В этих обстоятельствах, которые применимы к некоторым африканским странам, для MDA используются ежегодная двойная терапия (IVE + ALB) или двухгодичная монотерапия ALB. Таким образом, необходимы альтернативные глистогонные средства, в идеале соединения, которые могут достичь макрофилярицидной (то есть лечебной) эффективности, но которые безопасны в регионах с онхоцеркозом и лоазом.

С этой целью были вложены значительные средства в средства против Wolbachia .Эти методы лечения нацелены на бактериальный симбионт Wolbachia , который необходим для развития, роста и выживания многих нитчатых паразитов. Было показано, что нацеливание на Wolbachia с помощью антибиотиков обладает лечебной эффективностью против лимфатического филяриоза [53] и, что важно, безопасно для введения в коэндемичных регионах L. loa [54]. Однако доступные в настоящее время эффективные антибиотики не подходят для стратегий общественного здравоохранения в отношении MDA из-за противопоказаний и продолжительности лечения, и поэтому требуются новые соединения.

Современные глистогонные средства — онхоцеркоз

Онхоцеркоз (речная слепота) вызывается инфекцией Onchocerca volvulus. Начиная с 1970-х годов были предприняты большие усилия по снижению бремени этой болезни, сначала с помощью борьбы с насекомыми-переносчиками, а затем с помощью MDA пожертвованного ивермектина.В 2018 г. более 150 миллионов человек в пострадавших районах получили ивермектин [55]. Этот макроциклический лактон является эффективным микрофилярицидом, но не убивает взрослых нематод. Поэтому ивермектин необходимо вводить ежегодно или два раза в год в течение многих лет для уничтожения паразита в популяции. Прогресс впечатляет: онхоцеркоз в значительной степени контролируется как проблема общественного здравоохранения в большинстве стран Африки [56], а четыре страны Северной и Южной Америки — Колумбия, Эквадор, Гватемала и Мексика — добились ликвидации паразита [57,58].

Были также успешны попытки улучшить MDA для лечения онхоцеркоза путем перепрофилирования лекарств из ветеринарии. Недавно в исследовании III фазы было показано, что моксидектин превосходит ивермектин в снижении плотности микрофилярий через 12 месяцев после однократного приема [59]. Ожидается, что такая большая продолжительность действия снизит передачу паразитов между ежегодными раундами MDA, ускоряя прогресс в направлении элиминации.Эмодепсид — еще один ветеринарный препарат, очень перспективный для перепрофилирования. Он продемонстрировал активность в доклинических моделях различных возбудителей гельминтов человека и в настоящее время применяется для лечения онхоцеркоза в соответствии с соглашением между Bayer и Инициативой по лекарствам от забытых болезней [60]. Завершены испытания на безопасность фазы I (NCT03383614).

Ведение и борьба с ГПГ, шистосомами и филяриатными паразитами в первую очередь зависит от химиотерапии и обучения.Хотя вакцины против круглых червей и власоглавов разрабатываются, разработка все еще находится на доклинической стадии [61-65]. Вакцина против анкилостомы находится на более продвинутой стадии разработки [66], а вакцина против шистосомоза проходит клинические испытания фазы III [67], однако в настоящее время вакцины в этой области не используются.

Текущий ассортимент противогельминтных средств и ландшафт открытий лекарств от паразитарных гельминтозов немногочислен.Это контрастирует с ситуацией в отношении малярии и кинетопластидных инфекций, когда усилия, в частности, Инициативы по лечению забытых болезней и предприятия по лекарствам от малярии в партнерстве с различными фармацевтическими компаниями, в настоящее время окупаются улучшенным конвейером разработки лекарств и утверждением тафенохин ( 11 ) и фексинадол ( 10 ) [68,69]. В связи с растущими опасениями по поводу возможного возникновения устойчивости к применяемым в настоящее время противогельминтных средств, возможности изменения климата, влияющего на распространение этих паразитов, в сочетании с неспособностью имеющихся в настоящее время химиотерапевтических средств повлиять на передачу паразитов и низкой эффективностью некоторых из этих препаратов, e .грамм. против Trichuriasis , необходимость в новых подходах к разработке противогельминтных средств является насущной. Кроме того, большинство глистогонных средств ограничены их слабой межфиловой активностью, например, празиквантел (PZQ, 5 ) эффективен против трематод и цестод, но не против нематод. Только бензимидазолы 1 и 2 проявляют некоторые более широкие эффекты, но гораздо более активны против нематод, чем против цестод или трематод [70]. В идеале было бы желательно иметь антигельминтное средство с широкой активностью против различных гельминтозов, хотя на это может быть слишком много надежды, учитывая эволюционное расстояние между различными целевыми типами.

В нынешнем виде дорожная карта ВОЗ по NTDs, в которой изложен всеобъемлющий план по контролю, устранению и искоренению NTDs, вряд ли принесет желаемые результаты к 2020 году. Поскольку дорожная карта NTD 2030 находится в стадии развертывания, срочно требуется потребность в новых глистогонных средствах для искоренения этих болезней бедности.

Применение открытой науки для разработки противогельминтных средств

Коммерческие стимулы для разработки противогельминтных средств

Несмотря на острую потребность в новых лекарствах и других средствах борьбы с гельминтозной инфекцией человека, эти показания в значительной степени игнорировались фармацевтической промышленностью, предположительно по коммерческим причинам.Действительно, в период с 2000 по 2011 год никаких новых химических соединений не было одобрено [71,72]. С тех пор были одобрены только моксидектин ( 8 , 2018) и триклабендазол ( 9 , 2019). Основные препараты, используемые для борьбы с гельминтозными инфекциями у людей, клинически используются в течение многих лет: ивермектин ( 7 , одобрение FDA в 1996 г.), мебендазол ( 2 , 1974), альбендазол ( 1 , 1996), празиквантел. ( 5 , 1982), диэтилкарбамазин ( 6 , 1950).Нехватка новых лекарств отражает ограниченные экономические стимулы для стимулирования коммерческих инвестиций в лечение забытых тропических болезней, таких как гельминтозы человека.

Были предприняты усилия по продвижению таких инвестиций. Ваучерная программа FDA по тропическим заболеваниям направлена ​​на создание коммерческого стимула для разработки новых лекарств от болезней, которым в противном случае не уделялось бы должного внимания [73,74].Организации, которые успешно одобрили соответствующий критериям лекарственный препарат, получают переводной ваучер для дальнейшего приоритетного рассмотрения, имеющего существенную ценность. В последние годы в рамках этой программы были поддержаны два антигельминтных препарата: моксидектин ( 8 ), превосходящий ивермектин ( 7 ) при онхоцеркозе [59], и триклабендазол ( 9 ), одобренный для лечения фасциолеза, хотя оба препарата были одобрены. Первоначально разработанный для ветеринарных показаний, триклабендазол ( 9 ) использовался для лечения фасциолеза в течение многих лет до утверждения FDA, связанного с ваучерной программой (рис. 2).

Рисунок 2: Структуры новых глистогонных препаратов, разработанные путем перепрофилирования, и новые лекарства или лекарственные препараты-кандидаты для других забытых болезней, разработанные в рамках инициатив государственно-частного партнерства (ГЧП).* Обозначает стереогенный центр: тафенохин ( 11 ) вводят в виде рацемической смеси.

Рисунок 2: Структуры новых глистогонных препаратов, разработанных путем перепрофилирования, и новых лекарств или кандидатных лекарственных средств …

Государственно-частные партнерства (ГЧП), которые обычно объединяют различные организации, такие как фармацевтические компании, правительства и благотворительные организации, в настоящее время доказывают свою эффективность в обеспечении одобрения лекарств от забытых тропических болезней.Например, фексинидазол ( 10 ) был разработан некоммерческой организацией «Лекарства от забытых болезней» в партнерстве с Санофи, Швейцарским институтом тропиков и общественного здравоохранения и другими организациями. В настоящее время он одобрен как первый пероральный препарат для лечения африканского трипаносомоза человека на всех стадиях [69,75]. В рамках партнерства между компанией Medicines for Malaria Venture и GSK был разработан тафенохин ( 11 ), который эффективен в качестве однократного препарата для радикального лечения малярии Plasmodium vivax [68].Хотя ни один из этих примеров не относится к гельминтозной инфекции, они показывают, что эти организационные модели могут быть успешными при внедрении новых молекул в клиническую практику. На более ранней стадии разработки консорциум anti- Wolbachia (A · WOL), партнерство, включающее Ливерпульскую школу тропической медицины и AbbVie, обнаружило ABBV-4083 ( 12 ), антибиотик, эффективный в доклинических моделях в качестве макрофилярицида. воздействуя на бактериальный эндосимбионт Wolbachia [76] (рис. 2).WIPO Re: Search — еще одно государственно-частное партнерство, которое облегчает работу с забытыми тропическими болезнями за счет объединения интеллектуальной собственности, опыта, возможностей и финансирования фармацевтических компаний, университетов и некоммерческих организаций. Количество и размах проектов, в том числе многих в области гельминтозов, которые поддерживаются этой организацией с момента ее основания в 2011 году, впечатляют [77].

Открытая наука: эффективная модель инноваций в лекарствах

Альтернативный способ содействия открытию противогельминтных препаратов — снижение затрат за счет внедрения исследовательских стратегий, которые делают инновации в лекарствах более эффективными [72].Открытие лекарств с открытым исходным кодом — это модель, которая стремится полностью открыть исследовательский процесс [78]. У этого есть несколько радикальных преимуществ, которые бросают вызов традиционным открытиям лекарств. Секретность и хранение данных в разрозненных хранилищах, например, когда отдельные исследовательские группы ждут публикации своих данных, ограничивают нашу способность получать доступ к лучшим идеям. Открытость может создавать сообщества, которые сотрудничают и привлекают новый опыт, когда это необходимо, или по счастливой случайности создают новые направления, поскольку разные люди со всего мира и из разных областей приносят свежие идеи.Своевременный обмен данными ускоряет исследования и позволяет избежать непреднамеренного повторения усилий. Более широкое сообщество разработчиков лекарств постепенно приспосабливается к этим типам проблем, яркими примерами которых являются ChEMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) и PubChem (NIH). Оба сосредоточены на характеристике молекул, подобных лекарству, и предоставлении информации для всеобщего сведения. Первая — это база данных биоактивных молекул, созданная вручную, цель которой — объединить химические, биоактивные и геномные данные, чтобы помочь трансляции геномной информации в новые эффективные лекарства [79].Последняя представляет собой открытую базу данных, в которую исследователи могут загружать научные данные, включая биологические результаты, чтобы другие могли их использовать [80].

Возможно, самым ярким примером открытия лекарств с открытым исходным кодом в чистом виде является проект Open Source Malaria [81,82]. Это платформа для исследований, связанных с малярией, с упором на разработку лекарств. В основе этого проекта лежат полностью открытые электронные лабораторные записные книжки, в которых сразу же отражается вся работа, проделанная по различным направлениям исследования проекта.Результаты публикуются и публично обсуждаются, а приоритеты устанавливаются на странице проекта Github. Важно отметить, что любой может свободно вносить предложения, и действительно, проект «Открытый исходный код по борьбе с малярией» успешно получил качественные взносы из самых разных источников. Изюминкой этой работы стало подробное исследование ряда противомалярийных арилпирролов [82]. Нам не известно о подобных усилиях в режиме реального времени с полностью открытым исходным кодом, применяемых для обнаружения глистогонных средств, но это было бы захватывающей перспективой для этой области.Однако исследователи свободно выпускают открытые инструменты, полезные для открытия лекарств, открыто описывают свои усилия по скринингу соединений и участвуют в распределенных проектах скрининга открытых библиотек, таких как «Ящик для патогенов компании« Лекарства от малярии ». Недавно Тим Гири и его коллеги отметили, что миллионы соединений были проверены в промышленных и академических лабораториях на изолированных гельминтах, но скорость открытия лекарств была очень низкой, поэтому необходимо приложить усилия для расширения сотрудничества между различными группы, преследующие эту стратегию [83].Далее они предполагают, что обмен как положительными, так и отрицательными данными скрининга через онлайн-базы данных является приоритетом, чтобы сосредоточить внимание на наиболее многообещающих соединениях и уменьшить избыточность усилий. Такая структура совместного использования данных должна быть приоритетом для данной области.

C. elegans: модельный организм для паразитологии и образец открытого сообщества

С.elegans в качестве модели нематоды

Caenorhabditis elegans ( C. elegans ) — это непаразитический нематодный червь, который встречается во всем мире и был выбран Сиднеем Бреннером в качестве генетического модельного организма для биологических исследований с большим потенциалом для нашего понимания биологии развития и нейробиологии. [84]. В 1998 г. он стал первым сложным эукариотом, чей геном был секвенирован [85]. C. elegans встречается как гермафродиты, так и самцы, и его способность к гермафродитному размножению (самоопылению) способствует долгосрочному сохранению генетических штаммов.Способность замораживать и хранить штаммы в глицерине увеличивает его полезность. Прозрачность червя облегчает исследования по развитию, и C. elegans остается единственным сложным организмом, для которого описана вся клеточная линия [86]. За эту новаторскую работу Бреннер, Хорвиц и Сулстон были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2002 года. Нервная система, которая составляет 358 из 959 соматических клеток гермафродита, является единственной, для которой известна полная электрическая схема [87], что облегчает исследования нейронной передачи сигналов и нервных и нервно-мышечных расстройств [88], а также исследования в области понимания глистогонное действие препарата [89,90].

Выращивать и поддерживать C. elegans в лаборатории относительно просто. Их небольшой размер (1 мм в длину, как у взрослых) означает удобство хранения. Их быстрый жизненный цикл (примерно 3 дня от яйца до взрослой особи) и короткая продолжительность жизни (примерно 2–3 недели) при кормлении на диете из E. coli облегчают генетические исследования.Прямая и обратная генетика удобны для использования в C. elegans . Богатое разнообразие мутантов доступно в Центре генетики Caenorhabditis [91]. Открытие РНК-интерференции, доставляемой через двухцепочечную ДНК питающихся червей [92], открыло дверь к нокдауну генов в масштабе генома в поисках новых мишеней для лекарств. Эти подходы могут ускорить проверку лекарственных мишеней и идентификацию новых потенциальных молекулярных мишеней.

Итак, как свободноживущий червь может способствовать нашему пониманию паразитарных нематод и разработке глистогонных препаратов? Ключевым преимуществом является простота выращивания C.elegans . Большое количество может быть получено быстро и с низкими затратами, что позволяет проводить высокопроизводительные химические и генетические скрининговые исследования. Часто бывает трудно или невозможно провести сопоставимые исследования паразитических червей из-за проблем с сохранением паразитических червей вне их хозяина, хотя модели грызунов доступны для многих классов гельминтов [93].

Хотя C.elegans явно не является организмом-мишенью, его можно использовать для поиска новых антигельминтных средств для здоровья животных и человека. Можно проводить экраны на предмет новых химических выводов, которые затем можно применять к другим паразитическим видам. C. elegans химический скрининг генов, облегчающий деконволюцию молекулярной мишени и механизма действия, также полезен. Например, Бернс и его коллеги проверили 67 012 соединений, чтобы определить те, которые убивают C. elegans , а затем повторно проанализировали попадания в два вида паразитических нематод и две модели позвоночных (клетки HEK293 и рыбок данио).Таким образом, они идентифицировали 30 структурно различных антигельминтных молекул свинца [94]. Они также определили мишень (комплекс II цепи переноса электронов) одного соединения свинца, которое показало нематодную специфичность и наномолярную активность. Эта работа показывает, что C. elegans может быть эффективным, рентабельным и может сыграть определенную роль в процессе открытия антигельминтных препаратов.

Еще одним потенциальным признаком в контексте исследования паразитов является легкость, с которой C.Геном elegans можно манипулировать, что делает возможным создание трансгенных C. elegans , экспрессирующих мишени противогельминтных препаратов, от паразитических червей [95,96]. Эти подходы все еще находятся в зачаточном состоянии, но такие генетические модификации могут привести к поддающимся оценке фенотипам, отражающим свойства мишени паразитарного лекарственного средства, которые в будущем могут быть использованы для высокопроизводительных химических и генетических (РНКи) подходов к скринингу.

Однако существуют ограничения на использование C.elegans в качестве инструмента исследования, особенно его врожденной физической и ферментативной защиты от ксенобиотиков, факторов, важных для выживания в естественной среде обитания. В результате, C. elegans в некоторой степени недоступен для некоторых химикатов, а это означает, что для наблюдения изменений фенотипа могут потребоваться высокие концентрации определенных соединений [90,97].

Aroian и его коллеги [98], в соответствии с работой Burns et al.[94], советуют с осторожностью полагаться на данные только по C. elegans , что имеет смысл, поскольку он никогда не является основным организмом-мишенью. Они проверили библиотеку соединений против взрослых и свободноживущих личинок (анализ развития личинок от яйца до L3i, E2L) паразита анкилостомы человека Ancylostoma ceylanicum и против C. elegans . Они обнаружили, что анализ A. ceylanicum E2L был более успешным при идентификации соединений, активных против A.ceylanicum взрослых, чем анализов C. elegans (более низкий уровень ложноотрицательных результатов). Эти работы привели к тестированию четырех соединений с активностью in vitro на модели инфекции хомяков in vivo A. ceylanicum — сульконазола ( 13 ), эконазола ( 14 ), парарозанилина ( 15 ) и цетилпиридиния хлорида ( 16 ) (Рисунок 3). Из них парарозанилин ( 15 ) показал значительное снижение яйценоскости паразитов в этой модели, несмотря на отсутствие активности у C.elegans .

Рисунок 3: Соединения с антигельминтной активностью идентифицировали комбинацией скрининга против Ancylostoma ceylanicum, C. elegans и T. muris [98].

Рисунок 3: Соединения с антигельминтной активностью, идентифицированные комбинацией скрининга против Ancylostoma c …

Возможно, одна из лучших причин для интеграции C.elegans в процесс открытия заключается в том, что если будут идентифицированы интересные новые молекулы, которые активны как на паразите-мишени, так и на генетическом модельном организме, но точная цель остается неясной, тогда генетика C. elegans может предложить путь для идентификации мишени, которая было бы трудно по любому другому маршруту.

Модель

C.Сообщество elegans : исторически открытая научная модель

Исследование C. elegans было начато исследователями, включая Виктора Нигона, Эллсуорта Догерти и Жана-Луи Бруна [99]. Однако использование C. elegans в качестве модельного организма в таких областях, как генетика, биология развития и нейробиология, было установлено Сиднеем Бреннером в 1960-х годах в лаборатории молекулярной биологии MRC в Кембридже, Великобритания [100].Важной особенностью исследований C. elegans было сообщество исследователей с давними традициями открытости и обмена идеями и реактивами, которые мы сегодня можем признать примером открытой науки [101].

Примером такой открытости является информационный бюллетень для исследователей C. elegans , The Worm Breeder’s Gazette, , который сочетает в себе советы и предложения по методам с неформальным сообщением о новых открытиях перед публикацией.Например, о отмеченном Нобелевской премией использовании зеленого флуоресцентного белка в качестве маркера было сообщено в Gazette Мартином Чалфи и его коллегами за пять месяцев до рецензируемой публикации [101-103].

Второй пример истории открытой науки C. elegans — это проект генетической карты и секвенирования генома под руководством Джона Салстона и Боба Уотерстона, в результате которого получено C.elegans в 1998 году первым многоклеточным организмом, геном которого был секвенирован. В проекте участвовали команды Центра секвенирования генома Медицинской школы Вашингтонского университета (Сент-Луис, Миссури, США) и Центра Сэнгера (Хинкстон, Кембридж, Великобритания), разделяющих убеждение, что «вместе мы можем сделать больше», а не «один против другого» [104]. Важной особенностью было то, что геномные клоны были доступны бесплатно, что позволило исследователям исследовать интересующие гены [101]. Более того, генетическая и геномная информация быстро распространилась в форме базы данных ACeDB, сначала через gopher, ранний интернет-сервис, а затем через WormBase [105,106].

Эти исторические примеры иллюстрируют силу открытой науки в исследовательской традиции C. elegans . В следующих разделах этого обзора мы обсудим, как подходы открытой науки продолжают оставаться важными в области открытия глистогонных и противопаразитарных препаратов.

Открытые подходы к идентификации цели

Геномные ресурсы важны для идентификации мишени, особенно в случае паразитов, поскольку этапы жизни, обнаруженные у хозяина, часто трудно получить или культивировать, а молекулярные инструменты доступны лишь немногие.WormBase ParaSite [107] является важным центральным источником геномных данных о гельминтах [108]. На момент написания эта база данных содержит информацию о 142 видах паразитов и других гельминтов, включая геномы, данные сравнительной геномики и исследования RNAseq, а также ряд инструментов, облегчающих доступ к этим данным, включая браузер генома, BioMart (инструмент для экспорт таблиц выбранной информации) и REST API, интерфейс для программного доступа к базе данных.

Но как мы можем перейти от геномной информации к новым лекарствам? Недавнее сравнительное исследование геномики, проведенное крупным международным консорциумом исследователей, действительно помогло в решении этого вопроса, сравнив геномы 81 вида паразитических и непаразитических червей (как нематод, так и платигельминтов) [109].Эта работа произвела большие открытые наборы данных, такие как расширенные семейства генов, относящиеся к паразитизму, и анализы метаболизма у различных паразитов через типы, важные для изучения метаболизма в поисках новых лекарств. Кроме того, это исследование предсказало многообещающие противогельминтные мишени и соединения, которые могут взаимодействовать с этими мишенями, тем самым определив лекарства для потенциального использования в качестве противогельминтных средств.

После идентификации целей желательно получить генетическое / фармакологическое подтверждение концепции для проверки цели.В то время как методологии РНК-интерференции и CRISPR теперь применяются к самим паразитам [110-112], неизбежно крупномасштабные функциональные геномные ресурсы в основном обнаруживаются у C. elegans.

Консорциум C. elegans Gene Knockout получил предполагаемые нокаутные мутации примерно в 15 000 генов и теперь принял CRISPR / Cas9 для расширения ресурса на каждый ген в геноме [113].Также доступна дополнительная коллекция нокаут-мутантов из Национального проекта по биоресурсам в Японии [114]. Оба проекта открывают доступ к мутантам по невысокой цене.

Еще одним ресурсом с открытым исходным кодом, который можно сразу же применить для идентификации и проверки целей, является Open Worm Movement Database [115]. Это открытая платформа для анализа и обмена данными о поведении червей, например, полученными с помощью программного обеспечения для отслеживания червей.Например, исследователь может искать штаммы червей с определенным фенотипом движения, например с низкой скоростью движения. Эти парализованные или плохо передвигающиеся мутанты червей могут быть источником новых нейромышечных антигельминтных мишеней. Исследователь может сразу просмотреть видео с обнаруженными штаммами червей на YouTube, чтобы подтвердить свою гипотезу.

Открытые инструменты для фенотипического скрининга

Недавно многие лаборатории по всему миру осознали необходимость разработки новых антигельминтных соединений, поэтому начали программы скрининга на различные патогены и модели.Несмотря на растущие знания о потенциальных мишенях для новых глистогонных средств, фенотипический скрининг, включающий анализы паразитов или моделей in vitro, остается важным [83]. В результате было разработано несколько методов и платформ для повышения скорости и надежности проверки.

В этом разделе мы обсуждаем новейшие методы и системы фенотипирования и то, как они были применены для открытия антигельминтных средств.Мы концентрируемся на тех, где исходный код программного обеспечения и / или аппаратная часть сделаны ясно и открыто. Методы, приложения и расположение исходного кода / дизайна приведены в Таблице 3.

Открытые инструменты для фенотипического скрининга подвижности и жизнеспособности

Несколько групп разработали системы сбора и анализа изображений для высокопроизводительного фенотипического скрининга паразитов (таблица 3), обычно используя подход порогового определения разностных изображений / фильмов для количественной оценки подвижности, иногда сегментируя изображение путем распознавания интересующего организма [116] .

Таблица 3: Открытые инструменты для высокопроизводительного фенотипического скрининга подвижности и жизнеспособности и их использование для обнаружения антигельминтных средств.

орудие труда	подтверждено	исходный код / ​​описание (лицензия)
WormScan [117] автоматизированный WormScan [118]	С.грохот с высокой пропускной способностью elegans [119]	бумажная подтверждающая информация [117,118]
Срок службы машины [120]	C. elegans анализ продолжительности жизни	Github [121] (GPLv3)
WormAssay [122] Червячок [123]	Brugia malayi (взрослые особи и микрофилярии) , Cooperia spp.L3, Dirofilaria immitis microfilariae , Schistosoma mansoni [122,123]	Github [124] (GPLv2 или новее)
Подвижность цестод ImageJ macro [125]	Echinococcus multilocularis protoscoleces	бумажная подтверждающая информация [125]
Макрос ImageJ индекса движения [126–128]	несколько экранов библиотеки с высокой пропускной способностью с H.contortus [129–134]	бумажная подтверждающая информация [126]
Образец INVAPP [135]	экраны библиотеки с T. muris и C. elegans [39,135-137]	Github [138] (лицензия MIT)
CellProfiler [139] Шистосомный конвейер CellProfiler [140] CellProfiler WormToolbox [141]	С.скрининг ингибиторов тиоредоксин-глутатионредуктазы mansoni [140], C. elegans высокопроизводительный скрининг живых / мертвых [141]	Github [142] (лицензия BSD) CellProfiler опубликовал веб-сайт трубопроводов [143]

WormScan — это метод, использующий планшетный сканер для получения последовательных изображений, при этом интенсивный свет сканера эффективно стимулирует движение червя [117].Эта система была использована для скрининга библиотеки из 26000 соединений в анализе роста C. elegans [119]. Недавно была опубликована обновленная версия этого программного обеспечения (Automated WormScan) [118]. Машина продолжительности жизни также использует сканер для получения изображений и имеет возможность одновременно отслеживать тысячи червей и определять время гибели отдельных червей на пластинах [120].

WormAssay — это комбинация видеокамеры и программного обеспечения с открытым исходным кодом.Он использует два алгоритма (оценка оптического потока Лукаса – Канаде и метод изменения пикселей) для определения подвижности макропаразитов в микротитровальных пластинах [122]. Worminator основан на WormAssay для использования с микроскопическими паразитами [123]. Эта система была проверена для определения антигельминтной активности против различных нематод и шистосом. Скрининг с использованием Worminator показал, что ауранофин является многообещающим кандидатом для повторного использования в качестве средства лечения лимфатического филяриоза и онхоцеркоза [144].Этот препарат был первоначально одобрен для лечения ревматоидного артрита, но в настоящее время проходит испытания при амебиазе и лямблиозе (NCT02736968).

Макрос ImageJ [145], который определяет подвижность протосколекций Echinococcus multilocularis внутри микротитровальных планшетов с помощью порогового определения разности пикселей, был использован для идентификации противоглистного соединения MMV665807 [125].Wiggle Index, еще один макрос ImageJ для определения пороговых значений различий и количественной оценки подвижности, широко использовался для скрининга в масштабе библиотеки извлеченных из оболочки Haemonchus contortus L3 [127–130]. INVAPP Paragon, установка визуализации и сценарий анализа MATLAB, который снова использует пороговую разницу для количественной оценки подвижности, был использован для скрининга библиотеки с Trichuris muris и C. elegans [39,135,136].

CellProfiler — это крупный пакет с открытым исходным кодом для количественного измерения фенотипов по данным визуализации, особенно с высокопроизводительных экранов [139].Некоторые группы разработали методы анализа гельминтов с помощью CellProfiler. Подход виртуального скрининга был использован для идентификации ингибиторов тиоредоксин-глутатионредуктазы S. mansoni [140]. Затем эти виртуальные совпадения были протестированы на высокопроизводительном экране на основе CellProfiler с использованием Schistosomula S. mansoni , который определяет как подвижность, так и ряд других фенотипических показателей, что привело к идентификации 2 новых малых молекул с различными химическими каркасами 17 и 18 с активностью против шистосомул и взрослых червей при низких микромолярных концентрациях (рис. 4).Другой набор инструментов CellProfiler позволяет количественно определять жизнеспособность и флуоресценцию C. elegans [141].

Рисунок 4: Ингибиторы тиоредоксин-глутатионредуктазы S. mansoni , обладающие глистогонным действием [140].

Рисунок 4: Ингибиторы тиоредоксин-глутатионредуктазы S. mansoni , обладающие глистогонным действием [140].

Открытые инструменты для более детального анализа физиологии гельминтов

Сложные программные и аппаратные методы были разработаны для фенотипирования более тонких аспектов биологии червей, чем анализы паралича / подвижности / жизнеспособности.Эти методы могут составить плодотворную основу для поиска соединений, которые обладают антигельминтным действием in vivo, но не вызывают паралич, возможно, включая аспекты взаимодействия с хозяином, нарушение секреции белков или другие способы повреждения червя [146]. Они также полезны для более подробного понимания механизма действия глистогонных соединений, поскольку было признано, что мы не полностью понимаем, сколько глистогонных средств действуют — например, концентрации макроциклических лактонов, парализующих червей in vitro, намного выше, чем концентрация, достигаемая эффективными дозами in vivo [147].

Было создано несколько различных систем с открытым исходным кодом для отслеживания движения червя C. elegans [148-151]. Эти системы обычно измеряют ряд параметров помимо скорости, таких как изгиб, развороты и другие аспекты поведения. CeleST — аналогичная система количественного анализа передвижения с открытым исходным кодом, которая измеряет аспекты поведения нематод при плавании [152].Насколько нам известно, такие системы не использовались с гельминтозными паразитами, но такие исследования были бы плодотворными для детального анализа антигельминтных действий.

Микрожидкостные системы обладают огромным потенциалом для помощи в обнаружении антигельминтных средств, позволяя проводить детальную продольную микроскопию отдельных червей. Они обладают потенциалом для значительного уменьшения количества соединения, необходимого для скрининга, что позволяет экономично проводить скрининг более крупных библиотек.Обнадеживает то, что некоторые авторы сделали свои конструкции микрожидкостных микросхем общедоступными, что позволило использовать и модифицировать их другими группами. Stress-Chip — это чип, который позволяет изолировать сотню червей на аренах с одним червем и отслеживать, как химические вещества протекают через червей [153]. Файл CAD для производства микрофлюидного устройства был доступен на Figshare по лицензии CC BY 4.0 [154]. Сообщалось о другом 10-камерном микрофлюидном устройстве для изоляции червей, первоначально предназначенном для визуализации червей для количественной оценки поведения во сне во время развития, и файл CAD доступен во вспомогательной информации [155].

Стоимость оборудования, конечно, часто вызывает беспокойство, особенно для групп, работающих с забытыми тропическими болезнями и / или в развивающихся странах. Недавно в рамках открытого аппаратного проекта сообщалось о Incu-Stream, системе долгосрочной визуализации, способной автоматически сканировать лунки микропланшетов и записывать видео движения червя для дальнейшего анализа [156].Авторы предоставили список деталей с общей стоимостью материалов 184 доллара. Схемы, файлы САПР и соответствующее программное обеспечение доступны на Github [157].

Открытые подходы к разработке терапии

Ящик с патогенами, проект

The Pathogen Box — это коллекция из 400 соединений, которая была предоставлена ​​в свободный доступ некоммерческой партнерской организацией по разработке продуктов Medicines for Malaria Venture (MMV) [158].Соединения продемонстрировали активность против ряда патогенов тропических болезней, которым не уделяется должного внимания [159]. Это научный проект с открытым доступом, с единственным условием, что исследователи соглашаются поделиться своими результатами. Эта модель является продолжением успешной MMV Malaria Box, где 55 групп собрали результаты более чем 290 различных анализов с помощью разнообразных скринингов, связанных не только с малярией, но и с другими забытыми тропическими болезнями [160].

Проект Pathogen Box в настоящее время активен, но несколько групп уже сообщили о глистогонных скринингах с использованием этой библиотеки [129,135,161-165].Мы собрали результаты этих опубликованных экранов на рисунке 5. Эти результаты уже подчеркивают, как открытый подход позволяет тестировать библиотеку против множества различных организмов, что позволяет исследователям идентифицировать соединения, активные против множества патогенов, и определять их приоритетность. Например, MMV6, который первоначально был разработан как ингибитор кинетопластид дигидрофолатредуктазы [159], активен против трех видов трематод ( F. hepatica, S. haematobium, S. mansoni [161]) и цестода E.multilocularis [162].

Рисунок 5: Активные соединения из антигельминтных скринингов с использованием MMV Pathogen Box. NTS: недавно трансформированная шистосомула, xL3: exsheathed L3. Схема анализа и ссылки на источники данных: C.elegans экран роста / подвижности — автоматическая количественная оценка с использованием системы INVAPP [135]. Экран подвижности C. elegans — автоматическая количественная оценка с использованием системы WMicrotracker ONE [163]. Экран жизнеспособности C. elegans — автоматическая количественная оценка жизнеспособности путем дифференциальной абсорбции красителей DB-1 и йодида пропидия [164]. E. multilocularis метацестодный скрининг — повреждение оценивали путем количественной оценки активности фосфоглюкозоизомеразы, высвобожденной в культуральную среду [162]. F. hepatica скрининг — жизнеспособность метацеркарий оценивалась с использованием системы оценок, учитывающей повреждение мембран и прозрачность двуустки, а жизнеспособность взрослых особей оценивалась с помощью системы оценок, учитывающей подвижность, цвет и жесткость червей [165]. Экран H. contortus — автоматическая количественная оценка подвижности выведенных из оболочки червей L3 [129], экранов S. haematobium и S. mansoni — активность оценивалась с использованием системы баллов с учетом подвижности и морфологических / тегументальных изменений [161 ].

Рисунок 5: Активные соединения из антигельминтных скринингов с использованием MMV Pathogen Box. НТС: недавно преобразованный сланец …

Возможно, наиболее многообещающим лидером из Pathogen Box на данный момент является толфенпирад, инсектицид пиразол-5-карбоксамида, который впервые был идентифицирован как антигельминтное средство с активностью против стадий паразитарной жизни L3 и L4 вне оболочки Haemonchus contortus, основного паразита жвачные животные [129].Последующие исследования продемонстрировали активность против модельной нематоды C. elegans [135, 163]. Толфенпирад ( 19 ) оказался очень активным, со значением IC ₅₀ от 0,02 до 3 мкМ в различных анализах H. contortus и 0,2 мкМ в анализе C. elegans [129,135]. Последующее исследование выявило два дополнительных соединения пиразол-5-карбоксамида с активностью против H. contortus, , хотя и не улучшило эффективность толфенпирада [166].Толфенпирад действует у членистоногих как ингибитор митохондриального комплекса I [167]. Будет интересно, сможет ли производное толфенпирада перейти к испытаниям, поскольку это будет новый механизм действия антигельминтного средства, хотя некоторые митохондриальные разобщители, такие как клозантел ветеринарной медицины, активны против Fasciola hepatica [168].

Недавно были предприняты попытки в области медицинской химии для определения взаимосвязи между структурой глистов и активностью толфенпирада ( 19 ) [169].Основная цель этой работы заключалась в снижении липофильности толфенпирада 19 , который считался нежелательным для перорально вводимого агента, что характерно для глистогонных средств, по сравнению с пестицидом, наносимым на поверхность. Это было достигнуто за счет систематического изменения пиразол-5-карбоксамида и феноксибензилоксигрупп в толфенпираде 19 (Таблица 4).

Таблица 4: Сильная антигельминтная активность производных толфенпирада ( 19 ) против H.contortus. Активность показана для двух анализов in vitro: одного для подвижности xL3 (черви стадии L3 без оболочки) и второго для развития xL3 на стадии L4 [169].

Систематическое изменение p -метилфенильного кольца в пределах 19 привело к появлению ряда ароматических и гетероароматических аналогов с аналогичными уровнями активности толфенпирада (Таблица 4).Например, замена метильной группы на атом хлора в 20 поддерживала одинаковые уровни активности как в анализе подвижности xL3, так и в анализе развития L4. Аналогично, замена p -метилфенильной группы на 2-метилпирид-5-ильную группу в 21 в значительной степени сохраняла эффективность, в то же время снижая липофильность. И наоборот, модификации пиразольной группы привели к более резким изменениям активности. Например, если изменение этильного заместителя в пределах 20 на метильный заместитель в 22 дало небольшое увеличение активности, удаление этильной группы в 23 показало существенное улучшение активности со значением IC ₅₀ . для подвижности xL3 улучшился до 0.38 мкМ и для развития L4 до 0,7 нМ, с аналогичной активностью для соответствующего производного фторпиразола 24 . Эти два последних соединения 23 и 24 показали высокую селективность в отношении паразита с низкой цитотоксичностью или без нее. Далее авторы продемонстрировали, что 24 проявили широкую активность против других моделей паразитов нематод: H. polygyrus, A. ceylanicum и T. muris. Широко связанный ряд 1-метил-1 H -пиразол-5-карбоксамида также был детально исследован, при этом были выявлены соединения, которые показывают значительно улучшенную эффективность и селективность по сравнению с толфенпирадом [131 170].

Празиквантел (

5 )

Шистосомоз — серьезное тропическое заболевание, возникающее в результате заражения трематодным паразитом, кровяной двуусткой Schistosoma mansoni [171]. После малярии это второе по значимости паразитарное заболевание, от которого страдают миллионы людей во всем мире.Вакцины нет, но препарат празиквантел ( 5 ) является эффективным средством лечения. Его вводят детям или целым сообществам, часто в программах массового приема лекарств (MDA) [172]. Прискорбным недостатком является то, что лекарство в настоящее время производится и вводится в виде рацемической смеси. Чистый активный энантиомер был бы предпочтительнее по нескольким причинам, например, неактивный энантиомер связан с нежелательными побочными эффектами, а также имеет очень горький вкус.

С целью поиска синтетического пути к активному энантиомеру был создан открытый веб-сайт, и в него было вовлечено несколько групп, как академических, так и коммерческих лабораторий.В результате возникли два разных подхода к проблеме, которых до сих пор не было (рис. 6). Гидролиз до промежуточного амина 25 , который затем был разделен производным винной кислоты, был решением, которое возникло в результате этого подхода с открытым исходным кодом. Другое решение было найдено спонсируемой исследовательской группой по контракту. Это включало другое промежуточное соединение 26 , которое затем, в свою очередь, было разделено с использованием самой винной кислоты. Подробный отчет об успешном процессе разрешения был опубликован Мэтью Тоддом и его коллегами [173].Это еще не привело к тому, что чистый энантиомер стал широко доступным, но создание открытого научного проекта стало стимулом к ​​решению сложной проблемы. В настоящее время проводится набор клинических испытаний фазы III, посвященных проверке безопасности и эффективности ʟ-празиквантела (NCT03845140).

Рисунок 6: Два подхода к разрешению энантиочистых PZQ ( R ) — 5 , обнаруженных посредством A) открытой науки и B) контрактных исследований [173].

Рисунок 6: Два подхода к разрешению enantiopure PZQ ( R ) — 5 обнаружено через A) открытая наука и B) против …

Антигельминтное средство — ивермектин, пирантел Пармоат и другие

---

Изображение: Лекарство, отпускаемое по рецепту, в бутылке с таблетками.Брэндона Гисбрехта. Лицензия: CC BY 2.0

.

---

Определение

Глистогонные или противогельминтные средства — это препараты, которые убивают или изгоняют паразитов. Применяются для лечения различных заболеваний, вызываемых паразитами, например гельминтами.

Гельминты делятся на следующие категории:

• Нематоды (круглые черви)
• Platyhelminthes (плоские черви)
• Трематоды (сосальщики)
• Цестоды (ленточные черви)

Обзор гельминтозов

Гельминты имеют сложный жизненный цикл с участием различных видов хозяев и переносчиков на разных стадиях их жизненных циклов.При большинстве паразитарных инфекций человек выступает в роли хозяина паразитов.

Есть несколько основных причин гельминтоза:

• Плохая гигиена .
• The Потребление воды и продуктов питания, загрязненных фекалиями человека или животных или недоваренным мясом (свинина и рыба).
• Некоторые паразиты попадают в организм человека через кожу и укусы насекомых (onchocerca volvulus, Wuchereria bancrofti).

Различные виды гельминтов

Изображение: «Taenia Solium Scolex (x400)» 커뷰 — Собственная работа.Лицензия: CC BY-SA 3.0

.

Ленточные черви

Taenia saginata, Taenia solium, Hymenolepis nana

Промежуточные хозяева ленточных червей ( T. saginata и T. solium ) — крупный рогатый скот и свиньи.

Taenia solium (свиной цепень) чаще всего встречается в Азии и Латинской Америке. В США это происходит у иммигрантов из этих стран. Вызывает нейроцистицеркоз . Основной путь передачи к человеку — употребление в пищу недоваренных продуктов из свинины.Яйца ленточного червя попадают в организм путем орально-фекального заражения.

Taenia saginata , также называемая говяжьим цепнем, не вызывает нейроцистицеркоз. Обычно люди заражаются T. saginata после употребления недоваренной говядины. Он вызывает тениоз в кишечнике и безвреден. В основном остается бессимптомным .

Виды эхинококков

Изображение: «Echinococcus Granulosus» Ганимедеса — Собственная работа. Лицензия: CC BY-SA 4.0

.

E.granulosus, E. multilocularis, E. vogeli

Промежуточными хозяевами этой инфекции являются овца, , а основными хозяевами являются собака . При определенных условиях человек может действовать как промежуточный хозяин. Личинки могут развиваться в эхинококковые кисты в тканях, обычно в печени (две трети пациентов).

Flukes

Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum

Трематоды рода Schistosoma вызывают шистосомоз .Ее также называют лихорадкой улиток , потому что разные типы улиток являются хозяевами рода Schistosoma . Заражение может произойти при контакте кожи человека с зараженной водой. Осложнения возникают, когда организм производит иммунологическую реакцию на яйца паразита Schistosoma , пойманные в ловушку в различных тканях. Яйца достигают кожи, мозга, мышц, надпочечников и глаз. В конце концов, чрезмерный воспалительный процесс вызывает повреждение органа .

Тканевые круглые черви

Trichinella spiralis, Dracunculus medinensis (морской червь), Wuchereria bancrofti, Loa loa, Onchocerca volvulus, Brugia malayi

Изображение: « Wuchereria bancrofti Микрофилярия Wuchereria bancrofti , от пациента, осмотренного на Гаити». Лицензия: Public Domain

Взрослые филярии этих типов червей находятся в основном в лимфатической системе, соединительных тканях или брыжейке хозяина.Они производят живые эмбрионы, называемые микрофиляриями , которые перемещаются в кровотоке через передачу от комаров или подобных насекомых , когда они кормятся.

После развития во вторичном хозяине личинки переходят в ротовой аппарат насекомого и повторно вводятся человеку.

Распространенными филяриями являются онхоцеркоз (наличие микрофилярий в глазу, вызывающее «речную слепоту» ), лоаз (микрофилярии вызывают воспаление кожи и других тканей), трихинеллез (личинки из живородящие самки в кишечнике мигрируют в скелетные мышцы, где они инцистируются).

Изображение: «Инфекция в ноге, вызванная Wuchereria bancrofti ». пользователя Неизвестный. Лицензия: CC BY-SA 3.0

.

Круглые черви

Ascaris Lumbricoides, Toxocara Canis

Аскаридоз — наиболее распространенная кишечная нематодная инфекция. Остается бессимптомным у большинства пациентов, но он может вызвать легочное осложнение (кашель, хрипы) и кишечную непроходимость в тяжелых случаях. Обычно это распространено в районах с плохой санитарией и гигиеной.

Анкилостомы

Ancylostoma duodenale, Necator americanus

Причина заражения — проникновение личинок через кожу . Достигнув легкого, личинки мигрируют в ротовую полость и заглатываются. Анкилостомы прикрепляются к слизистой оболочке кишечника и питаются через хозяина.

Противогельминтные препараты

Альбендазол

Препарат обладает широким спектром активности нейроцистицеркоза , эхинококкоза , аскаридоза , анкилостомоза и трихоцефалита .Препарат действует путем ингибирования полимеризации β-тубулина у гельминтов , тем самым нарушая микротрубочки-зависимые функции, такие как поглощение глюкозы у гельминтов.

Биодоступность альбендазола составляет менее 5% при приеме натощак. Пациентам следует рекомендовать прием препарата вместе с жирной пищей для усиления абсорбции. Побочные эффекты включают боль в животе, тошноту, рвоту и повышение уровня печеночных трансаминаз . Они обычно преходящи и обычно не требуют отмены препарата. LFT следует контролировать во время терапии альбендазолом.

Мебендазол

Препарат эффективен против целого ряда кишечных и тканевых нематодных инфекций, включая аскаридоз , анкилостомоз , энтеробиоз и трихоцефалез . Мебендазол является предпочтительным лекарством для лечения множественных инвазий и более эффективен, чем альбендазол, против трихоцефалеза.

Местом действия препарата является микротрубочковый белок β-тубулин паразита.Он с высоким сродством связывается с β-тубулином червя и ингибирует его полимеризацию. Он также блокирует захват глюкозы гельминтами.

Альбендазол и мебендазол эффективны против следующих паразитов:

Изображение: « Trichinella Spiralis в мышечной ткани». пользователя Doc. RNDr. Йозеф Райшиг, CSc. — Авторский архив. Лицензия: CC BY-SA 3.0

.

• Ascaris lumbricoides
• Некатор американский
• Trichinella spiralis
• Enterobius vermicularis
• Trichuris trichiura
• Эхинококк
• Strongyloides stercoralis
• Taenia solium
• Микроспоридии

Тиабендазол

Тиабендазол является более старым производным бензимидазола и, помимо терапевтического эффекта против различных гельминтов, обеспечивает облегчение симптомов в случаях кожной мигрирующей личинки в случаях.Он также облегчает симптомы со стороны скелетных мышц, возникающие при миграции в мышцы личинок Trichinella spiralis .

Механизм действия тиабендазола аналогичен действию альбендазола. Тиабендазол обладает противовоспалительным, обезболивающим и жаропонижающим действием . Побочные реакции включают головокружение, тошноту, рвоту, сонливость, зуд, головную боль, нервно-психические расстройства, гепатит и реакции гиперчувствительности, включая синдром Стивенса-Джонсона .Суспензия тиабендазола для местного применения используется при кожной мигрирующей личинке.

Диэтилкарбамазин (DEC)

DEC представляет собой производное пиперазина, которое эффективно против лимфатического филяриоза , лоаоза и висцеральной личинки migrans . Он эффективен только против микрофилярий (личинок) стадии различных паразитов. Не убивает взрослых паразитов ( микрофилярия, ), .

Его точный механизм действия неясен, но DEC может действовать, изменяя паразита, так что он становится восприимчивым к нормальным иммунным ответам хозяина ( фагоцитоз ).Он также может влиять на метаболизм арахидоната гельминтов .

DEC — препарат выбора для лоаоза и для филяриоза , вызванного Wuchereria bancrofti и Brugia malayi . Распространенными побочными эффектами являются тошнота, потеря аппетита, головная боль, слабость и головокружение.

Praziquantel

Празиквантел активен против шистосом , цестод и их личиночных форм, но не нематод.Он вызывает утечку внутриклеточного кальция из клеточных мембран паразитов, вызывая контрактуру и паралич. Парализованные ленточные черви вытесняются из слизистой оболочки кишечника и выводятся из кишечника. Шистосомы Flukes и также очищаются от тканей и вен.

Общие побочные эффекты — потеря аппетита, головокружение, сонливость, головная боль, недомогание, боли в животе, тошнота, рвота и потоотделение. Нежелательные эффекты обычно преходящи и редко имеют клиническое значение.

Празиквантел — препарат выбора для лечения цистицеркоза , вызванного T. solium . Побочные эффекты более заметны у пациентов с тяжелой паразитарной нагрузкой из-за продуктов распада, выделяемых мертвыми червями.

Празиквантел противопоказан для лечения глазного цистицеркоза , так как разрушение организма может вызвать необратимое повреждение глаз. Празиквантел считается безопасным для беременных и кормящих женщин (препарат категории В).

Пиперазин

Пиперазин высокоактивен против инфекций Ascaris и Enterobius , с коэффициентом излечения 90–100%.Он вызывает гиперполяризацию мускулов червя, открывая хлоридные каналы, вызывая расслабление и подавляя реакцию на сократительное действие ACh. Происходит вялый паралич, и черви изгоняются живыми. Пиперазин безопасен и хорошо переносится. Случайные побочные эффекты включают тошноту, рвоту, дискомфорт в животе и крапивницу.

Пирантел памоат

Этот препарат эффективен против следующих гельминтов:

• Ascaris lumbricoides
• Некатор американский
• Enterobius vermicularis

Это деполяризующий нервно-мышечный блокирующий агент, вызывающий паралич паразита.Он также подавляет холинэстеразу. Он плохо всасывается в желудочно-кишечном тракте.

Важно: Наиболее эффективен против кишечных паразитов. Следует соблюдать осторожность при лечении пациента с нарушением функции печени.

Никлозамид

Активен против T. saginata , Diphyllobothrium latum, и Hymenolepis nana , а также остриц. Препарат подавляет окислительное фосфорилирование в митохондриях и препятствует анаэробной выработке АТФ у ленточных червей.Таким образом, организмы умирают от дефицита АТФ. Однако никлозамид не убивает яйцеклетку / личинку. Его следует использовать с осторожностью в случаях T. solium из-за повышенного риска висцерального цистицеркоза.

Он минимально всасывается из желудочно-кишечного тракта, и системной токсичности не происходит. Хорошо переносится; иногда у пациентов может быть незначительный абдоминальный симптом . Недомогание, зуд и головокружение возникают редко. Никлозамид безопасен во время беременности и у пациентов с плохим здоровьем.

Левамизол

Левамизол эффективен при аскариде ( A. lumbricoides ). Он обладает никотиноподобным действием, стимулируя и блокируя нервно-мышечные соединения . Следовательно, это вызывает паралич паразитов, и они выводятся из организма через кал. Побочные эффекты возникают редко, но могут включать тошноту, боль в животе, головокружение, усталость, сонливость или бессонницу.

Ивермектин

Получают из Streptomyces avermitilis .Ивермектин действует на глутаматные хлоридные каналы ( GluCls ), присутствующие у протостомных беспозвоночных. Они контролируют передвижение и питание паразитов. Ивермектин вызывает гиперполяризацию GluCls , что приводит к параличу и смерти паразита.

Важно: Ивермектин эффективен только на стадии личинок различных паразитов. Он не убивает взрослых паразитов.

Изображение: «Жизненный цикл О.заворот ». Джованни Маки, полученный из образа CDC на http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Filariasis.htm — Basáñez M-G, Pion SDS, Churcher TS, Breitling LP, Little MP, et al. (2006) Речная слепота: история успеха под угрозой? PLoS Med 3 (9): e371. doi: 10.1371 / journal.pmed.0030371 (ссылка на изображение). Лицензия: CC BY 2.5

.

Ивермектин активен против следующих паразитов:

• Onchocerca volvulus
• Strongyloides stercoralis
• Ascaris lumbricoides
• Trichuris trichiura
• Enterobius vermicularis
• Филяриатоз

Онхоцеркоз вызывается Onchocerca volvulus — вектором является черная муха (род Simulium).Люди являются хозяевами Onchocerca volvulus . Заболевание еще называют речной слепотой . Чаще всего он встречается в западноафриканской саванне района и обычно вызывает слепоту у пораженных людей в возрасте 40–50 лет.

Ивермектин (150 мкг / кг, пероральный прием внутрь) убивает 90% микрофилярий в течение одной недели лечения. Однако терапию необходимо продолжать в течение 10-12 лет (на протяжении всей жизни паразита), чтобы убить паразита.Он имеет длительный период полувыведения 48-60 часов.

Побочные эффекты обычно вызваны гибелью паразитов . К ним относятся лихорадка, головная боль, легкий зуд, головокружение, слабость, сыпь, тошнота, боль в животе, запор, летаргическая боль в суставах / мышцах, гипотензия , тахикардия, отек и . Эти реакции обычно легкие и продолжаются в течение двух дней после лечения.

У некоторых пациентов (1–3%) реакция могла быть тяжелой из-за высокой температуры, гипотонии и бронхоспазма . Кортикостероиды назначают в таких случаях для купирования побочных эффектов. Ивермектин противопоказан беременным и кормящим женщинам.

Битионол

Его назначают вместе с триклабендазолом для лечения инфекций ( фасциолез, ), вызванных двуусткой овец ( fasciola hepatica ) . Механизм действия неизвестен.

Препарат выбора для лечения гельминтозов

Круглые черви (нематоды)

• Ascaris lumbricoides : (мнемоника: PAM) Памоат пирантела, альбендазол, мебендазол
• Necator americanus : ( PAM) Памоат пирантела, альбендазол, мебендазол
• Trichuris trichiuria : Альбендазол, Мебендазол
• Strongyloides stercoralis : Ивермектин
• Enterobius vermicularis : Памоат пирантела, Мебендазол
• Trichinella spiralis : Мебендазол или альбендазол
• Кожная мигрирующая личинка: Альбендазол, Ивермектин
• Wucheria bancrofti и Brugia malayi : DEC (диэтилкарбамазин)
• Onchocerca volvulus : Ивермектин

Трематоды (трематоды)

• Schistosoma haematobium : празиквантел
• Schistosoma mansoni : Praziquantel
• Schistosoma japonicum : Praziquantel
• Paragonimus westermani : Praziquantel
• Fasciola hepatica : битионол или триклалбендазол
• Fasciolopsis buski : празиквантел или никлозамид

Ленточные черви (цестоды)

• Taenia saginata : Празиквантел или никлозамид
• Taenia solium : Празиквантел
• Цистицеркоз : Альбендазол
• Diphyllobothrium latum : Празиквантел или никлозамид
• Echinococcus granulosus : Альбендазол
• Loiasis : DEC

Открытие высоко синергетической комбинации глистогонных средств, которая демонстрирует взаимную гиперчувствительность

Реферат

Гельминты или нематоды, передающиеся через почву (анкилостомы, власоглавы и аскариды), представляют собой круглые черви, которые поражают более 1 миллиарда беднейших людей и являются ведущими причинами заболеваемости по всему миру.Для лечения доступно несколько глистогонных средств, и только один широко используется при массовом введении лекарств. Срочно необходимы новые антигельминтики, и кристаллические (Cry) белки, производимые Bacillus thuringiensis , являются многообещающими новыми кандидатами. Комбинированная лекарственная терапия считается идеальным средством лечения инфекционных заболеваний. Удивительно, но мало что было сделано для определения характеристик комбинаций глистогонных средств. Здесь, посредством количественных анализов с диким типом и мутантами круглого червя Caenorhabditis elegans , мы устанавливаем парадигму для изучения глистогонных комбинаций с использованием белков Cry и агонистов никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR), например.g., трибендимидин и левамизол. Мы обнаружили, что агонисты nAChR и белки Cry, такие как Cry5B и Cry21A, взаимно демонстрируют то, что известно в области ВИЧ как гиперчувствительность — когда нематоды становятся устойчивыми к любому классу, они становятся сверхчувствительными к другому классу. Кроме того, мы обнаружили, что когда агонисты Cry5B и nAChR комбинируются, их активности сильно синергичны, давая значения индекса комбинации как хорошие или лучшие, чем наблюдаемые при комбинациях противоопухолевых, анти-ВИЧ и инсектицидов.Наше исследование предоставляет мощные средства, с помощью которых можно изучить комбинированную антигельминтную терапию и продемонстрировать, что комбинация агонистов nAChR и белков Cry обладает превосходными свойствами и, по прогнозам, дает улучшенные показатели излечения, при этом сопротивляясь развитию устойчивости к паразитам.

Кишечные круглые черви или нематоды — одни из самых распространенных паразитов человека сегодня, заражая более 2 миллиардов человек (1–3). Основные классы кишечных нематод включают анкилостомы ( Ancylostoma duodenale , Necator americanus ), власоглавы ( Trichuris trichiura ) и круглые черви ( Ascaris lumbricoides ).Кумулятивное воздействие этих паразитов огромно, вызывая анемию и задержку роста у детей, низкий статус питания, потерю аппетита, ухудшение когнитивных функций и умственных способностей (например, снижение рабочей памяти), ухудшение успеваемости в школе и учащение прогулов, сокращение будущая способность к заработной плате, анемия у беременных женщин, увеличение доли мертворожденных / перинатальных смертей / детей с очень низкой массой тела при рождении, рост младенческой смертности, рост материнской смертности, снижение производительности труда и производительной способности и слабость взрослых (2, 4– 7).Заражение этими паразитами также косвенно приводит к огромному бремени болезней через нарушение иммунной системы, что приводит к увеличению тяжести ВИЧ / СПИДа (более низкое количество CD4, более высокая вирусная нагрузка), повышенной восприимчивости к малярии, увеличению вероятности наличия активного туберкулеза (ТБ). и плохой ответ на противотуберкулезную вакцину, а также снижение иммунного ответа / неэффективность вакцины против холеры (8–14). Таким образом, кишечные круглые черви являются одним из самых серьезных заболеваний нашего времени и играют важную роль в обнищании инфицированных людей (15).

То, что воздействие кишечных нематод более скрыто, чем многие другие болезни, и что они затрагивают беднейшие слои населения, привело к отсутствию исследований и приверженности этим заболеваниям и практически к полному отсутствию разработки новых лекарств (глистогонных средств). С 1981 года только Китай начал клинические испытания на людях нового препарата — трибендимидина (16). Из горстки глистогонных средств в нашем арсенале только два — трибендимидин, никотиновый рецептор ацетилхолина, или nAChR, агонист (17), и альбендазол, бензимидазол — подходят для однократного массового введения лекарств (МДА).Оба обладают отличной активностью против Ascaris , умеренной (но не идеальной) активностью против анкилостомы и низкой активностью против власоглавов и остриц (18, 19). Для лечения МДА во всем мире используется только альбендазол, поскольку трибендимидин еще не одобрен во всем мире (20). Кроме того, как бензимидазолы, так и агонисты nAChR чувствительны к развитию паразитарной резистентности как в ветеринарии, так и в применении для человека (21-25). Таким образом, существует острая необходимость в новых глистогонных средствах.

Еще лучше было бы разработать глистогонную комбинированную терапию.Комбинации лекарств считаются идеальной терапией для лечения серьезных инфекционных заболеваний, включая ВИЧ, малярию и туберкулез (26–28), и играют важную роль в повышении терапевтической эффективности и замедлении развития резистентности. Например, комбинации лекарственных препаратов, входящие в состав высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), произвели революцию в лечении ВИЧ / СПИДа и позволили значительно увеличить продолжительность и улучшить качество жизни инфицированных людей (28). Однако на сегодняшний день систематических и количественных исследований противогельминтных комбинаций не проводилось.

К счастью, существует недорогая и мощная лабораторная нематода, которую, в принципе, можно использовать для облегчения изучения глистогонных средств — Caenorhabditis elegans . C. elegans сыграл ключевую роль в открытии механизма действия и устойчивости практически всех противогельминтных средств, а именно агонистов nAChR, бензимидазолов, алдикарба, ивермектина, порообразующих кристаллических (Cry) белков, производимых Bacillus thuringiensis ( Bt) и аминоацетилнитрилы (29–33).Такие исследования с паразитическими нематодами намного сложнее. Несмотря на эти фундаментальные открытия в отношении глистогонных средств, сделанные с использованием C. elegans , и несмотря на доступные мощные генетические и токсикологические инструменты, C. elegans игнорировалась при изучении комбинаций глистогонных средств.

Здесь мы используем дикий тип и мутант C. elegans , чтобы подробно охарактеризовать, как взаимодействуют два разных класса глистогонных средств. Мы обнаружили, что нематоды, устойчивые либо к белкам Bt Cry, либо к агонистам nAChR, реципрокно гиперчувствительны к другому классу по сравнению с нематодами дикого типа.Кроме того, при сочетании Cry-белки и агонисты nAChR обладают сильным синергическим действием, которое не уступает или лучше, чем у некоторых из лучших комбинированных терапий против других заболеваний. Таким образом, агонисты nAChR и белки Cry составляют новую и потенциально мощную комбинированную терапию против кишечных нематодных заболеваний.

Результаты

Мутанты, устойчивые к агонистам nAChR, обладают повышенной чувствительностью к антигельминтным средствам Cry-протеина.

Наша лаборатория впервые начала работу над натуральными белками Bt Cry, которые убивают нематод.Cry-белки интенсивно используются для борьбы с насекомыми-вредителями, в том числе в кампаниях по уничтожению с воздуха, программах борьбы с комарами, трансгенных культурах и органическом земледелии (34, 35). Мы охарактеризовали Cry-белки, летальные для свободноживущих нематод, паразитирующих на животных и паразитах растений (29, 36–38). Хотя белки Bt Cry смертельны для насекомых и нематод, они нетоксичны для позвоночных (35) и являются идеальными кандидатами для нового класса глистогонных средств. На сегодняшний день было продемонстрировано, что один белок Cry, Cry5B, обладает антигельминтной активностью in vivo против паразитарной инфекции анкилостомы у хомяков (29).

В рамках нашей разработки белков Cry как антигельминтных средств мы решили количественно проанализировать, как различные устойчивые к глистам нематоды реагируют на белки Cry. Эта информация важна для определения будущей полезности белков Cry против устойчивых к глистам нематод, которые могут появиться во время MDA. Хотя известно, что различные классы антигельминтных средств (например, агонисты nAChR, бензимидазолы) имеют разные механизмы действия, то, как мутанты, устойчивые к одному классу, реагируют на другой класс, подробно не оценивалось.Мы пришли к выводу, что C. elegans , для которой существуют мутанты, устойчивые почти ко всем различным классам глистогонных средств, предоставляет уникальные и мощные средства для изучения этого важного вопроса.

Мы проверили, как мутанты нематод, устойчивые к агонистам nAChR и бензимидазолам (два класса, применимые для однократных доз MDA против кишечных нематод), реагируют на белки Cry, используя три различных анализа интоксикации и следующие мутанты: lev-8 (ye493) , ben-1 ( e1880 ) и bre-5 (ye17) . lev-8 Кодирует субъединицу nAChR, которая мутирует в резистентность к левамизолу, пирантелу и трибендимидину; ye493 — нулевой аллель (17, 32). ben-1 Кодирует бета-тубулин, законсервированный у паразитических нематод, и мутирует в устойчивость к бензимидазолу у C. elegans и паразитических гельминтов (32). На сегодняшний день это единственный ген устойчивости к бензимидазолу. bre-5 Кодирует белок, участвующий в биосинтезе рецептора Cry5B, специфичного для беспозвоночных; ye17 — нулевой аллель (30, 39).

Мы неожиданно обнаружили, что нематоды, устойчивые к агонистам nAChR, обладают повышенной чувствительностью (HS) к Cry5B. Используя дозозависимый анализ смертности (40), мы обнаружили, что устойчивые к агонистам nAChR нематоды lev-8 (ye493) более чувствительны к Cry5B, чем нематоды дикого типа (диапазон доз 1,25–5,0 мкг / мл) (рис. 1 А ). Напротив, устойчивые к бензимидазолу нематоды ben-1 (e1880) более устойчивы к Cry5B, чем нематоды дикого типа (дозы 10–40 мкг / мл). Мы рассчитали значения LC ₅₀ (летальная концентрация 50% или доза, при которой половина нематод погибает) по каждой из этих кривых и обнаружили, что значение LC ₅₀ для нематод lev-8 (ye493) на Cry5B ниже (т.е., 50% из lev-8 животных погибают при более низкой дозе), чем у животных дикого типа, что подтверждает гиперчувствительность (Таблица S1). Гиперчувствительность к уничтожению с помощью Cry5B также наблюдалась у unc-50 (ye494) нематод, другого мутанта, устойчивого к агонистам nAChR, который изменяет сборку рецепторов (32) (фиг. 1 B и таблица S1).

Рис. 1.

мутантов, устойчивых к агонистам nAChR, обладают повышенной чувствительностью к кристаллическим белкам. ( A ) Дозозависимый ответ смертности нематод дикого типа N2 и мутантных нематод ben-1, lev-8 и bre-5 на очищенный Cry5B.( B ) Дозозависимый ответ смертности животных N2 дикого типа и unc-50 (ye494) животных на очищенный Cry5B. ( C ) Дозозависимая реакция ингибирования развития нематод дикого типа N2 и ben-1 , lev-8 и bre-5 мутантных нематод к E. coli , экспрессирующих Cry5B. ( D ) Дозозависимая реакция ингибирования развития нематод дикого типа N2 и нематод unc-63 (ye492) и unc-50 (ye494) на E.coli — экспрессия Cry5B. Меньший эффект, наблюдаемый с unc-63 , может быть связан с возможной ненулевой природой этого аллеля. ( E ) Влияние 10 мкг / мл очищенного Cry5B на 64-часовой размер расплода нематод N2 дикого типа, lev-8 , ben-1 и bre-5 мутантных нематод. Для A – D и на аналогичных рисунках ниже каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Значения LC ₅₀ и IC ₅₀ для подверженности Cry5B можно найти в таблице S1.Для E каждая полоса показывает 64-часовые выводки от 15 червей; планки погрешностей представляют стандартное отклонение. Для A – E и на всех аналогичных рисунках ниже * P <0,05 относительно N2; ** P <0,01 относительно N2; и *** P <0,001 относительно N2. Аллели, используемые здесь и на всех других рисунках, - это ben-1 (e1880), lev-8 (ye493) и bre-5 (ye17) .

Подобные поразительные результаты были получены с использованием анализа ингибирования развития. Мы поместили личинок первой стадии от одних и тех же мутантов в различные концентрации Escherichia coli ( E.coli ) -экспрессировали Cry5B и подсчитали количество нематод, которые смогли развиться до взрослого состояния за 60 часов при 20 °, за время, за которое все нематоды дикого типа в отсутствие токсина развиваются до взрослого состояния. В этом анализе устойчивые к агонистам nAChR нематоды lev-8 (ye493) также очень HS по отношению к Cry5B в диапазоне доз (1,56–6,25%; рис. 1 C ). Мы рассчитали значения IC ₅₀ (ингибирующая концентрация 50% или доза, при которой половина нематод не может развиваться) для нематод дикого типа и lev-8 (ye493) нематод, и обнаружили, что lev-8 мутантов больше более чем в 2 раза более восприимчивы к Cry5B, чем дикий тип (Таблица S1). ben-1 Нематоды не проявили заметной устойчивости к Cry5B в этом анализе (фиг. 1 C ), но оказались HS на основании значений IC ₅₀ (таблица S1). Используя этот анализ ингибирования развития, мы обнаружили, что два других мутанта, unc-63 (ye492) и unc-50 (ye494) , устойчивость к агонистам nAChR также были HS к Cry5B (фиг.1 D и таблица S1 ).

В качестве третьей меры интоксикации мы рассмотрели реакцию на Cry5B каждого из мутантов в отношении плодовитости нематод.Мы обнаружили, что при нормировании к количеству потомства, продуцируемого на нетоксиновых контролях, lev-8 (ye493) взрослых особей производят примерно на 60% меньше потомства на Cry5B, чем взрослые особи дикого типа (рис. 1 E ; P ). <0,05). Существенной разницы между нематодами дикого типа и ben-1 (e1880) не наблюдалось. Таким образом, на основе трех различных показателей интоксикации, относящихся к борьбе с глистами, и с использованием до трех различных мутантов, устойчивых к nAChR, мы наблюдали, что нематоды, устойчивые к агонистам nAChR, были HS к Cry5B по сравнению с нематодами дикого типа.

Чтобы выяснить, применима ли повышенная восприимчивость к белкам Cry, отличным от Cry5B, мы проверили реакцию нематод, устойчивых к nAChR, на Cry21A. Как и Cry5B, Cry21A обладает анти-нематодной активностью против многих свободноживущих нематод (38), но имеет только 41% аминокислотную идентичность Cry5B от N-конца до конца токсинового домена. Cry21A отличается от других глистогонных средств тем, что мы обнаружили, что мутагенизированному C. elegans труднее развить устойчивость к Cry21A, чем альбендазолу, ивермектину, левамизолу или Cry5B (Таблица S2).Cry5B также обладает превосходными свойствами в этом отношении по сравнению с альбендазолом и левамизолом.

На сегодняшний день, однако, ни один белок Cry, кроме Cry5B, не обладает антигельминтной активностью in vivo (29). Чтобы выяснить, является ли Cry21A глистогонным средством, мы протестировали действие Cry21A на Heligmosomoides bakeri инфекции круглых червей у мышей [ H. bakeri является естественным кишечным паразитом мышей и является важной моделью инфекций аскариды у людей (41)] . Мы заразили мышей H.bakeri , а затем доставили перорально три дозы белка Cry21A или плацебо. Через пять дней мышей умерщвляли и подсчитывали количество кишечных взрослых паразитов. Обработка Cry21A привела к снижению количества паразитов на 40% по сравнению с плацебо (фиг. 2 A , P = 0,005), демонстрируя антигельминтную активность in vivo.

Рис. 2.

Влияние Cry21A на H. bakeri и C. elegans дикого типа и мутантные штаммы. ( A ) Антигельминтная активность Cry21A in vivo против паразита тонкого кишечника H.bakeri . Показано, что количество кишечных аскарид, нормализованных к среднему в контрольной группе плацебо (41,7 червей), после лечения инфицированных мышей плацебо (лизаты спор, без Cry21A) или лизатом кристаллов спор Cry21A (SCL). Показаны нормализованные количества гельминтов у каждой мыши ( n = 6 для плацебо; n = 5 для Cry21A; одно животное в группе Cry21A умерло от опухоли до лечения). Длинная горизонтальная полоса показывает среднее количество червей; меньшие столбцы указывают на SEM. ( B ) Дозозависимый ответ смертности N2 дикого типа и устойчивых к агонистам nAChR нематод lev-8 мутантных нематод на Cry21A SCL при 20 ° в течение 3 дней.Значения LC ₅₀ для воздействия Cry21A можно найти в таблице S1.

Затем мы выполнили дозозависимые анализы смертности с Cry21A и мутантными нематодами lev-8 . Как и в случае с Cry5B, мы обнаружили, что lev-8 нематод относились к HS к Cry21A (диапазон 2,5–5 мкг / мл), а также к HS к Cry21A на основе значений LC ₅₀ (рис. 2 B и таблица S1). . Таким образом, мутанты, устойчивые к агонистам nAChR, скорее всего, будут HS для порообразующих белков Cry в целом.

Мутанты, устойчивые к Cry5B, взаимно сверхчувствительны к агонистам nAChR.

Поскольку нематоды, устойчивые к агонистам nAChR, являются белками HS to Cry, мы спросили, что произойдет с нематодами, устойчивыми к белкам Cry, при воздействии агонистов nAChR. Поэтому мы количественно оценили эффекты агонистов nAChR, таких как трибендимидин, левамизол и пирантел, на тот же набор устойчивых к глистам нематод, как указано выше. Мы обнаружили, что нематоды bre-5 (ye17) Cry5B были более чувствительны к трибендимидину, чем нематоды дикого типа (диапазон доз 0,39–100 мкг / мл; рис.3 A ), левамизол (диапазон доз 24–48 мкг / мл; рис. 3 B ) и пирантел (рис. S1 A ). На основании значений LC ₅₀ , bre-5 (ye17) нематод по сравнению с нематодами дикого типа имеют в ~ 5 раз больше HS по сравнению с трибендимидином и в ~ 2 раза больше HS по сравнению с левамизолом (Таблица S1). Чтобы увидеть, насколько широко этот результат применим к другим мутантам, устойчивым к Cry5B, мы также протестировали мутант, устойчивый к Cry5B, bre-2 (ye31) . Эти нематоды также являются HS к трибендимидину, левамизолу и пирантелу (рис.3 C и D и рис. S1 B ). На основании значений LC ₅₀ , нематоды bre-2 примерно в 8 раз более чувствительны как к трибендимидину, так и к левамизолу (таблица S1). Результаты для нематод ben-1 (e1880) различаются для разных агонистов nAChR. ben-1 Нематоды являются HS к трибендимидину (хотя и в гораздо меньшей степени, чем у нематод, устойчивых к Cry5B к ​​трибендимидину; рис.3 A и таблица S1), но устойчивы к левамизолу на основании LC ₅₀ (таблица S1).

Рис. 3.

Cry5B-устойчивые мутанты являются сверхчувствительными к агонистам nAChR. ( A ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа и ben-1, lev-8 и bre-5 мутантных животных на трибендимидин. ( B ) Дозозависимый ответ смертности нематод дикого типа N2 и мутантных нематод ben-1, lev-8 и bre-5 на левамизол. ( C ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа и bre-2 (ye31) мутантных животных на трибендимидин.( D ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа и bre-2 (ye31) мутантных животных на левамизол. ( E ) Дозозависимая реакция ингибирования развития нематод дикого типа N2 и мутантных нематод ben-1, lev-8 и bre-5 на трибендимидин. ( F ) Влияние трибендимидина 25 мкг / мл на 64-часовой размер расплода нематод N2 дикого типа, lev-8 , ben-1 и bre-5 .

Как указано выше, мы проверили, распространяется ли эта повышенная восприимчивость на другие показатели интоксикации, имеющие клиническое значение, испытанные выше, а именно на ингибирование развития и репродуктивной функции.Мы обнаружили, что развитие Cry5B-устойчивых личинок bre-5 (ye-17) было HS, по сравнению с нематодами дикого типа, к агонисту nAChR трибендимидину в диапазоне доз ~ 5-20 мкг / мл и на основе Значения LC ₅₀ (рис.3 E и таблица S1). Устойчивые к Cry5B нематоды также были HS по сравнению с животными дикого типа в отношении стерилизующего действия трибендимидина (фиг. 3 F ; P <0,05). Устойчивые к бензимидазолу ben-1 (e1880) нематод, хотя и менее чем bre-5 (ye17) животных, показали некоторое количество HS к трибендимидину в анализе развития (рис.3 E и таблица S1), но не в репродуктивном анализе (рис. 3 F ).

Агонисты Cry5B и nAChR обладают сильным синергическим действием.

Приведенные выше данные демонстрируют, что развитие нематод, устойчивых к агонистам nAChR, на самом деле улучшает нематицидную активность Cry-белков, и что развитие нематод, устойчивых к Cry-белкам, улучшает нематицидную активность агонистов nAChR. Эти данные, однако, не измеряют, как каждый класс лекарств мог бы модулировать активность другого, если бы эти два класса были объединены.Другими словами, являются ли эффекты двух классов антагонистическими, аддитивными или синергетическими? Синергетический эффект — это нечто большее, чем аддитивное; антагонистический эффект меньше аддитивного (т. е. препараты подавляют друг друга). Синергетические взаимодействия необходимы, потому что они могут привести к повышению эффективности, снижению дозировки и побочной токсичности и, возможно, могут минимизировать развитие резистентности при клиническом применении (42). Обычно избегают антагонистических эффектов.

Чтобы количественно оценить влияние двух глистогонных средств друг на друга, мы подвергали нематод дикого типа C. elegans возрастающим дозам белков Cry и агонистов nAChR по отдельности и в комбинации при постоянном соотношении масс (мкг / мл) (рис. . 4). Например, дикого типа C. elegans подвергали воздействию различных доз Cry5B, трибендимидина и смеси обоих компонентов в массовом соотношении 1: 1 (например, 1 мкг / мл Cry5B + 1 мкг / мл трибендимидина). Червей проверяли на жизнеспособность в каждом из этих трех условий, которые показаны на рис.4 А .

Рис. 4. Комбинации агонистов

Cry5B и nAChR обладают сильным синергическим действием. ( A ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа на очищенный Cry5B, трибендимидин и соотношение Cry5B: трибендимидин 1: 1 в расчете на массу. На оси x отложена общая доза (например, 1 мкг / мл = 1 мкг / мл Cry5B, 1 мкг / мл трибендимидина или комбинация 0,5 мкг / мл каждого из них). ( B ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа на очищенный Cry5B, левамизол и соотношение Cry5B: левамизол 1: 1 в расчете на массу.( C ) Дозозависимая реакция смертности животных N2 дикого типа на очищенный Cry5B, трибендимидин и соотношение Cry5B: трибендимидин 1: 1 на основе значений LC ₅₀ . ( D ) Кривая доза-ответ животных N2 дикого типа на трибендимидин без и с низкой дозой Cry5B (2 мкг / мл), что обычно дает ~ 5% смертности. ЛЕВ, левамизол; Триб, трибендимидин.

Исходя из этих данных, мы можем рассчитать степень синергизма, используя алгоритм индекса комбинации (CI) Чжоу и Талалая (42).В общем, значения CI <1 указывают на синергию; > 1 указывают на антагонизм. Алгоритм ДИ использовался для расчета степени синергизма между комбинациями лекарств при химиотерапии рака [типичные значения синергического ДИ 0,1–0,8 (43–46)], вирусной терапии [значения синергического ДИ 0,5–0,8 (47, 48)] и инсектициды [синергетические значения доверительного интервала 0,3–0,9 (49, 50)]. Чтобы быть несколько консервативными, мы выбрали значения ДИ <0,7 как показатель синергизма и <0,3 как показатель сильного синергизма (42, 51). Используя этот алгоритм, мы рассчитали значения ДИ при ED ₅₀ (доза среднего эффекта). , ED ₇₅ , ED ₉₀ и ED ₉₅ комбинации и обнаружили значения CI, которые находились в диапазоне от 0.52–0,12, что свидетельствует о сильном синергизме между Cry5B и трибендимидином при смешивании в равных массовых дозах (таблица 1). Синергизм между двумя соединениями также был показан с использованием изоболограмм при этом соотношении смесей (рис. S2).

Таблица 1.

Значения индекса комбинации агонистов Cry5B и nAChR при различных уровнях эффективной дозы

Аналогичный эксперимент был также проведен с Cry5B и агонистом nAChR левамизолом, объединенным в фиксированном соотношении, основанном на массе (например, 1 мкг / мл Cry5B смешанный с 1 мкг / мл левамизола), как показано на рис.4 Б . На основании этих данных были рассчитаны значения доверительного интервала 0,38–0,15, что свидетельствует о сильном синергизме (таблица 1).

Чтобы определить, являются ли агонисты Cry5B и nAChR синергичными при других соотношениях комбинаций лекарств, мы объединили Cry5B и трибендимидин в соотношении 1: 1 на основе их значений LC ₅₀ (и двухкратных разведений вверх и вниз от этого значения; рис. 4 С ). Опять же, была замечена отличная синергия со значениями ДИ в диапазоне 0,48–0,27 (ЕС ₅₀ — ЕС ₉₅ ) (Таблица 1).Таким образом, Cry5B и трибендимидин также обладают синергическим действием при сочетании в соотношении, основанном на аналогичной эффективности.

Мы также рассчитали индекс снижения дозы (DRI) для глистогонных средств в различных комбинациях при определенных уровнях воздействия (таблица S3). DRI представляет собой меру того, во сколько раз доза каждого лекарственного средства в синергической комбинации может быть уменьшена по сравнению с дозой каждого лекарственного средства в отдельности при сохранении того же эффекта. Например, в ED ₉₀ для комбинации Cry5B и левамизола содержание Cry5B может быть уменьшено в ~ 6 раз, а левамизола ~ в 39 раз по сравнению с тем, что требуется для каждого из этих препаратов для достижения такого же эффекта самостоятельно.Эти данные предполагают, что белки Cry и агонисты nAChR взаимно усиливают друг друга и что, например, включение небольшого количества Cry5B может позволить значительное снижение количества агонистов nAChR для достижения сравнимых эффектов при использовании по отдельности. Чтобы проверить этот вывод, мы «добавили» дозозависимые анализы смертности трибендимидина с небольшой дозой Cry5B (2 мкг / мл), которая обычно обеспечивает жизнеспособность ~ 95%, и параллельно провели тесты без добавок. Небольшое количество Cry5B вызывало синергетическое взаимодействие с трибендимидином (рис.4 D ). Например, такая же летальность наблюдалась при использовании трибендимидина + Cry5B с концентрацией 20 мкг / мл, чем при использовании одного трибендимидина с концентрацией 200 мкг / мл.

Обсуждение

Здесь мы количественно анализируем два важных аспекта глистогонных взаимодействий — как нематоды, устойчивые к одному классу глистогонных средств, ведут себя по отношению к другим классам, и как два класса глистогонных средств ведут себя в сочетании друг с другом. Эти результаты легче достижимы с использованием C. elegans , чем с паразитическими нематодами.Каждая точка данных на нашем графике представляет ~ 100–200 нематод, и каждая точка данных берется в условиях культивирования, в которых нематоды полностью здоровы и способны завершить полный жизненный цикл, в отличие от анализов in vitro с паразитическими нематодами. Такие интенсивные количественные анализы, как эти, также непрактичны с анализами на паразитов in vivo, которые потребовали бы сотен позвоночных-хозяев на график.

Результаты поразительны — мы обнаружили, что нематоды, устойчивые к агонистам nAChR, являются гиперсознательными (HS) (по сравнению с нематодами дикого типа) к двум антигельминтикам белка Cry и, наоборот, нематоды, устойчивые к белку Cry, являются HS к трем агонистам nAChR.Гиперчувствительность наблюдалась с помощью трех различных клинически значимых показателей антигельминтной активности — смертности, торможения развития и стерилизации нематод. Почему сопротивление глистогонным средствам, действующим на нервно-мышечный переход, должно сделать нематод более восприимчивыми к порообразующим токсинам, которые атакуют кишечник, и наоборот, является неожиданным и предполагает большие пробелы в нашем понимании физиологии нематод. Хотя некоторая повышенная чувствительность наблюдалась между резистентными к бензимидазолу нематодами и трибендимидином, степень была менее устойчивой и не распространялась на все показатели активности или на левамизол.

Насколько нам известно, взаимная повышенная восприимчивость ранее не выявлялась при использовании каких-либо противогельминтных комбинаций и имеет серьезные последствия для антигельминтной химиотерапии. Повышенная чувствительность — ключевая характеристика одного из самых успешных противоинфекционных методов лечения на сегодняшний день — ВААРТ. В области ВИЧ повышенная чувствительность часто связана с комбинациями нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ) и ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) (52).Развитие вирусной устойчивости к одному классу приводит к повышенной восприимчивости ко второму классу. Комбинации HS связаны с улучшенными клиническими исходами и вирусологическим ответом (52–54), а также с улучшенными исходами устойчивости, такими как задержка / подавление устойчивости, снижение риска перекрестной устойчивости и даже изменение существующего фенотипа устойчивости (53–57). Опыт ВААРТ предполагает, что комбинация агонистов nAChR L-подтипа, таких как трибендимидин, с белками Cry должна привести к значительному улучшению клинических результатов, одновременно работая над предотвращением возникновения устойчивости к любому из этих препаратов.

Наши исследования HS были дополнены измерениями синергизма между агонистами nAChR L-подтипа и Cry5B. Насколько нам известно, количественная оценка синергизма между любыми глистогонными средствами еще не сообщалась. Эти данные демонстрируют, что агонисты nAChR Cry5B и L-подтипа проявляют сильную синергию при сочетании и значительно превышают предсказываемые простые аддитивные эффекты. Синергия очень желательна. Когда препараты, используемые в комбинированной терапии, обладают синергическим действием, терапевтическая эффективность каждого компонента значительно увеличивается.В результате в комбинированной терапии можно использовать гораздо меньшие дозы каждого лекарственного средства, чем в противном случае потребовалось бы, если бы каждое лекарство применялось индивидуально. Это приводит к снижению побочных эффектов лекарств и снижению стоимости. Что касается устойчивости, существует прецедент синергических взаимодействий, препятствующих развитию устойчивости, например, в случае синергизма между Cry и цитолитическими белками, обнаруженными в штаммах Bt, вызывающих москитоцид (58–60)

Выводы наших результатов глубоки.Из-за угрозы устойчивости к отдельным глистогонным средствам и того факта, что у нас нет единого препарата, который бы обладал высокой эффективностью против всех паразитов, для лечения срочно необходимы терапевтические агенты с новыми механизмами действия и, что более важно, продуманные комбинированные методы лечения. этих заболеваний (9, 18, 22). Превосходная комбинация белков Cry и агонистов nAChR L-подтипа потенциально представляет собой эволюцию противогельминтной химиотерапии, поскольку эта комбинация демонстрирует две разные характеристики — повышенную чувствительность и синергизм.Предполагается, что такая комбинация будет очень ценной при лечении МДА кишечных нематод, когда от десятков до сотен миллионов детей и беременных женщин нацелены на лечение однократной дозой. В таких обстоятельствах наличие мощной комбинированной терапии, вероятно, максимизирует терапевтический результат в одной дозе, задерживая / предотвращая резистентность, что может быть неизбежно при массовом применении отдельных глистогонных средств.

Таким образом, мы демонстрируем, что белки Cry и антигельминтные агонисты nAChR обладают мощным набором характеристик, определяемых взаимной повышенной восприимчивостью и сильным синергизмом.Эти данные определяют потенциально уникальную комбинированную терапию для лечения кишечных нематодных инфекций, которая, по прогнозам, будет очень сильной и устойчивой к развитию резистентности паразитов. Эти исследования также демонстрируют уникальную полезность C. elegans в изучении противогельминтной терапии и открывают дверь для аналогичных характеристик других противогельминтных комбинаций и методов лечения.

Материалы и методы

C. elegans Штаммы и реагенты.

штаммов C. elegans культивировали с использованием стандартных методик, включая использование штамма Escherichia coli OP50 в качестве стандартного источника пищи (61). Различным штаммам позволяли расти в течение разного времени при 20 ° от стадии L ₁ до стадии L ₄ перед тестированием на лекарствах, чтобы отразить небольшие различия в скорости их роста по сравнению с N2 дикого типа: unc-63 (ye492 ) , lev-8 (ye493) unc-50 (ye494), bre-2 (ye31) и bre-5 (ye17) позволяли развиваться в течение 45 часов.Животных дикого типа N2 и ben-1 (e1880) использовали через 44 часа. Приготовление Cry5B, трибендимидина, левамизола, пирантела, Cry21A и всех червячных пластинок и буферов было таким, как описано в других местах (17, 29, 38, 40, 62).

Анализы интоксикации.

Анализы смертности с агонистами nAChR и очищенным Cry5B были, как описано, в течение 6 дней при 25 ° (17, 40). Анализы со спорово-кристаллическими лизатами (SCL) Cry21A проводили в присутствии 15 мкг / мл тетрациклина для предотвращения заражения Bt и при 20 ° в течение 3 дней (62).Причина более низкой температуры и сокращения времени с анализами Cry21A заключалась в сохранении диапазона доза-ответ, аналогичного таковому для других лекарств, поскольку споры Bt, присутствующие в SCL Cry21A, увеличивают смертность. Каждый эксперимент проводился с ~ 20 нематодами L4 на лунку в трех повторностях лунок, а затем повторялся в трех независимых повторах [~ 100–240 нематод / точка данных; за исключением анализа на пирантел и bre-5 (ye17) , который проводили в двух экземплярах]. Все жидкие анализы проводились в специальной среде S.

Анализы ингибирования развития трибендимидина были такими, как описано ранее, при 20 ° (17). Тройные лунки и три независимых анализа были выполнены, как описано выше. Для измерения ингибирования развития с помощью Cry5B 20 нематод L1 высевали на планшеты ENG-IC с различным процентным содержанием Cry5B-экспрессирующего E. coli , разбавленного неэкспрессирующим Cry5B E. coli , как описано в другом месте (40), и инкубировали при 20 ° в течение 60 ч. Количество нематод, которые достигли / не достигли зрелости беременной, подсчитывали для каждой чашки.Эксперимент независимо повторяли трижды.

Для расчета размеров расплода отдельных червей L4 помещали с ресницей в 48-луночный планшет, содержащий 40 мкл OP50 (OD ₆₀₀ = 3,0) и трибендимидин или очищенный Cry5B в общем объеме 200 мкл (пять нематод на обработку). / анализ; три независимых анализа). Планшеты инкубировали 64 ч при 25 °. Потомство пипеткой переносили на пустую чашку с агаром NG для подсчета.

Влияние Cry21A на

H. bakeri инфекции у мышей.

Самок мышей Swiss Webster (возраст 6-8 недель) перорально инфицировали 150 личинками H. bakeri третьей стадии. Животных разделили на две группы, и на 15, 16 и 17 дни постинфекции давали либо 99 нМ / кг Cry21A SCL в 0,1 мл H ₂ O, либо 0,1 мл лизатов спор штамма хозяина Bt 4D22. На 22 день инфицированных мышей умерщвляли, удаляли и вскрывали их тонкий кишечник. Затем подсчитывали взрослых особей H. bakeri , присутствующих в тонком кишечнике.

Статистический и синергетический анализ.

LC _{50 значений} и 95% доверительный интервал были рассчитаны путем объединения всех данных из трех независимых экспериментов и использования PROBIT (из надстройки XLSTAT к EXCEL, Addinsoft). Все остальные анализы данных и графики были выполнены с помощью Prism 5 (программное обеспечение GraphPad). Для данных о размере выводка, попарные сравнения между группами проводились с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста HSD Тьюки. Для данных о развитии и смертности парные сравнения между группами и дозами проводились с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и пост-тестов Бонферрони.Результаты обработки Cry21A in vivo анализировали с помощью теста Стьюдента t (непарный, односторонний). Кривые комбинации лекарств были построены с помощью Prism 5. Результаты исследований комбинации (значения CI и DRI, графики изоболограмм) были обработаны с использованием программного пакета CompuSyn (CompuSyn) с модификацией, которую мы вручную добавили в поправку для взаимно неисключающих лекарств, а именно: не включены в программу CompuSyn. Эта модификация уместна, поскольку мы считаем, что два класса препаратов имеют полностью независимые способы действия и, в любом случае, приводят к более консервативным (т.е., выше) значения CI. Формула Чоу и Талалая, используемая для расчета значений CI, приведена в SI Text . Для комбинированных исследований, в которых Cry5B и трибендимидин должны были быть добавлены в соотношении 1: 1 на основе значений LC ₅₀ , мы провели пилотные эксперименты доза-реакция с трибендимидином и Cry5B непосредственно перед фактическими экспериментами. Основываясь на этих пилотных данных, мы затем выбрали 4 мкг Cry5B и 102 мкг трибендимидина в качестве дозы 1: 1 LC ₅₀ (и 2-кратные разведения вверх и вниз) и провели три независимых эксперимента по синергии (включая Cry5B, трибендимидин. Кривые зависимости доза-ответ от трибендимидина Cry5B +).В реальных экспериментах после анализа завершенных данных было обнаружено, что LC ₅₀ Cry5B и только трибендимидина составляли 4,6 мкг / мл и 78 мкг / мл соответственно. Таким образом, фактическое соотношение, присутствующее в этом эксперименте, было 1 × LC ₅₀ Cry5B: 1,5 × LC ₅₀ трибендимидина.

Благодарности

Мы благодарны сотрудникам Ароянской лаборатории за обсуждения. Мы благодарны докторам. Маргарет Вирт и Брюсу Табашнику за обсуждения. Некоторые штаммы нематод, использованные в этой работе, были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis , который финансируется Национальным центром исследовательских ресурсов Национального института здоровья (NIH).Эта работа финансировалась NIH AI056189 (R.V.A.).

Сноски

• ¹ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: raroian {at} ucsd.edu.

• Вклад авторов: Y.H. и Р.В.А. спланированное исследование; Y.H. и А. проведенное исследование; E.G.P. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Y.H. и Р.В.А. проанализированные данные; и Ю. и Р.В.А. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• ↵ * Для этой статьи с прямым представлением был назначен редактор.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/07107/DCSupplemental.

Активность комбинаций антиоксидантов и глистогонных препаратов против взрослой стадии Schistosoma mansoni

Шистосомоз остается одним из основных забытых тропических заболеваний. Лечение шистосомоза и борьба с ним основываются на одном лекарстве — празиквантеле (PZQ). Несмотря на свою эффективность, лечение PZQ имеет ряд серьезных недостатков, включая неспособность химиотерапии обратить вспять вызванный заболеванием фиброз и перспективу появления лекарственной устойчивости.Здесь мы исследовали новый терапевтический подход с антиоксидантными биомолекулами в сочетании с PZQ против стадии развития взрослых особей Schistosoma mansoni и яйцекладки in vitro , учитывая, что этот терапевтический подход достиг синергетической / аддитивной активности против личинок шистосом. Антиоксиданты куркумин и оксадиазол per se проявляли антишистосомную активность против взрослых червей, что приводило к серьезным морфологическим изменениям и смерти. Кроме того, антиоксидант флавон в сочетании с вандетанибом или иматинибом улучшал антишистосомную активность против взрослых форм.Однако, в отличие от них, эти комбинации антиоксидант-глистогонные средства были не столь эффективны против взрослых особей по сравнению с личиночными шистосомами. Тем не менее, антиоксиданты по отдельности или в сочетании с лекарствами подавляли яйцекладку.

1. Введение

Шистосомоз — одна из основных забытых тропических болезней. Возбудителями инфекции являются паразиты-гельминты рода Schistosoma [1], из которых три основных вида: Schistosoma mansoni , S. haematobium и S.japonicum , вызывают шистосомоз человека. Инфекция S. haematobium является причиной ~ 90% случаев в странах Африки к югу от Сахары и Международное агентство по изучению рака (IARC) считает канцерогенным. Несмотря на стратегии контроля, направленные на блокирование передачи, шистосомоз представляет собой повышенную заболеваемость в странах Африки к югу от Сахары, Восточной Азии и Бразилии, поражая> 200 миллионов человек и ~ 800 миллионов других людей, подверженных риску заражения [1]. В последнее время передача шистосомоза Haematobia возобновилась в южной Европе [2, 3].

На протяжении более 40 лет контроль и лечение шистосомоза основываются на одном лекарстве, празиквантеле (PZQ), которое в основном нацелено на паразитов, а не на последствия болезни [4]. Несмотря на свою эффективность против всех форм шистосомоза человека и низкую токсичность, препарат имеет серьезные недостатки, включая ограниченное действие на ювенильные шистосомы и яйца, поражения печени и селезенки в результате инфекции и высвобождения яиц взрослыми червями [5]. Более того, из-за обширного и длительного многократного использования PZQ есть законные опасения по поводу развития лекарственной устойчивости или снижения восприимчивости [4].Таким образом, существует консенсус в отношении насущной необходимости разработки новых, доступных и эффективных методов лечения этой изнурительной забытой тропической болезни. Такие стратегии, как перепрофилирование лекарств и / или комбинация биологически активных агентов с различными способами действия, могут сократить время и стоимость исследований и разработок лекарств [6, 7]. На наш взгляд, новые терапевтические подходы должны быть направлены не только на устранение паразита, но и на улучшение патологий, связанных с инфекцией.Во время иммунного ответа хозяина против паразита высвобождение активных форм кислорода (АФК) может нарушать клеточный антиоксидантный гомеостаз пораженных органов [8, 9]. Что касается инфекции S. haematobium , реактивные электрофильные соединения, в том числе эстрогеноподобные метаболиты, могут инициировать ассоциированное с инфекцией злокачественное новообразование [10, 11]. Гипотетически использование биомолекул с антиоксидантными свойствами может способствовать улучшению высвобождения АФК, восстановлению функции органов и / или предотвращению образования канцерогенных метаболитов.Некоторые антиоксиданты обладают многообещающими биологическими свойствами и считаются фармакологически безопасными [12, 13]. Они могут предотвращать повреждение ДНК [14], блокировать канцерогенез [15] и проявлять антишистосомную активность [16–18]. Эти свойства указывают на их потенциальные антишистосомные препараты.

Таким образом, мы предлагаем новый терапевтический подход, основанный на перепрофилировании лекарств и комбинации другого класса лекарств (глистогонных и противоопухолевых) с антиоксидантами (рис. 1), который в идеале должен обеспечивать двойной механизм действия: (1) устранять паразита. и (2) облегчить патологии, связанные с инфекцией.Мы предполагаем, что этот новый терапевтический подход может способствовать лечению шистосомоза. Ранее этот новый терапевтический подход был оценен на недавно трансформированной шистосомуле S. mansoni [17, 18]. Здесь мы оценили эти препараты и антиоксидантные комбинации против взрослой стадии S. mansoni и при откладывании яиц шистосомами in vitro .

2. Материалы и методы

2.1. Химические вещества и питательные среды

празиквантел (PZQ), 4-фенил-1,2,5-оксадиазол-3-карбонил-2-оксид (OXA), N -ацетилцистеин (NAC), флавон (Flav) и флубендазол (FBZ) были приобретены у Merck Sigma-Aldrich (Лиссабон, Sigma), ресвератрол (Resv) у Santa Cruz Biotechnology (Гейдельберг, Германия), артесунат (AS), вандетаниб (VDT), куркумин (Curc) и мелатонин (Mel). от Cayman Chemical (Анн-Арбор, Мичиган, США) и дипептид H- L -триптофан- L -серин-ОН (H-Trp-Ser-OH, DiPept) от Bachem (Бубендорф, Швейцария).Питательная среда RPMI 1640 и добавки, включающие пенициллин (10.000 Ед / мл) / стрептомицин (10 мг / мл), были от Merck Sigma-Aldrich и термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой (FBS) от Lonza (Базель, Швейцария). Для анализов in vitro исходные растворы 2-5 мг / мл были свежеприготовлены в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) (Sigma-Aldrich) и хранили при 4 ° C. Эти исходные растворы разводили в свежей культуральной среде перед добавлением к хорошо содержащимся взрослым червям.

2.2. Паразиты

Жизненный цикл S.Штамм mansoni поддерживается путем пассажа через улиток Biomphalaria glabrata и мышей CD1, полученных из Центра исследований переносчиков и инфекционных заболеваний Франсиско Камбурнака и содержащихся в ветеринарной клинике доктора Гонсалвиса Феррейры (INSA-Porto). Самок мышей CD1 (возраст 8 недель) инфицировали 160-180 церкариями методом погружения в хвост [19], и через 7-8 недель заражения взрослых червей S. mansoni были извлечены в асептических условиях путем перфузии печени. и брыжеечные вены [20].Червей промывали средой RPMI 1640 (Merck Sigma-Aldrich) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Эксперименты проводились в соответствии с законом DL 113/2013 Португальской Республики и Европейской директивой 2010/63 / UE и были одобрены отделом этики экспериментов на животных INSA-Porto (проект № 04/2018) и Главным управлением продовольствия и ветеринарии. .

2.3.

In Vitro Антишистосомная активность

Процедура оценки антишистосомной активности соединений по отдельности или в комбинации против взрослых червей была описана ранее [7].Вкратце, одну пару взрослых червей S. mansoni в копуле (одна самка и один самец) в среде RPMI 1640 (1 мл) помещали в каждую лунку 48-луночного планшета (Nunclon, Дания). Оценивали одну пару червей на анализ и выполняли 3 анализа на обработку. Скрининг тестируемых соединений проводили при концентрации 100 мкМ М и комбинации при постоянном соотношении (1: 1) при той же концентрации. Все соединения были приготовлены, как описано выше, и добавлены к среде RPMI 1640, содержащей червей, через 24 ч для восстановления после возможного стресса перфузии и адаптации к культуральной среде.Паразитов поддерживали в течение 72 часов в инкубаторе с постоянной температурой при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ в воздухе и наблюдали 1, 17, 24, 48 и 72 часа на двигательную активность, смертность и морфологию. переделки как описано [7, 21]. Взрослые черви, инкубированные с самой высокой концентрацией ДМСО (0,1%), служили отрицательным контролем. Яйца, выпущенные парой взрослых червей, были подсчитаны ранее после добавления лекарств и антиоксидантов по отдельности или вместе и после добавления соединений (1, 24, 48 и 72 ч).Фенотипические изменения регистрировали с помощью светового микроскопа (Nikon Phase Contrast 2, LDW 0,52, Япония). Вкратце, морфологические изменения оценивались в диапазоне от 0 до 3 (0 = все черви мертвы; 1 = минимальная активность (сильное снижение подвижности), серьезные морфологические / тегументальные изменения; 2 = замедленная активность (снижение подвижности), первые морфологические / тегументальные изменения. и 3 = полностью жизнеспособный, нормальная деятельность, без морфологических изменений) [21]. Взрослые черви считались мертвыми, если движение не наблюдалось в течение как минимум 2 минут.Процент эффекта рассчитывали, как описано [21], и все эксперименты проводили в трех экземплярах и представляли в виде значений (SD).

2.4. Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) был использован для оценки значимых различий между средними значениями% эффекта лекарств и комбинаций. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне <0,05.

3. Результаты и обсуждение

Новые терапевтические подходы, которые не только устраняют паразита, но также могут улучшить и облегчить патологии, связанные с инфекцией, необходимы против шистосомоза [16].Переназначение и комбинация лекарств с активными соединениями, имеющими другой механизм действия, может быть интересной стратегией [7]. Мы предположили, что комбинация лекарств с антиоксидантами не только может повысить эффективность лекарств для уничтожения паразитов, но также может облегчить последствия заболевания, связанного с инфекцией [16]. Ранее мы оценивали несколько классов лекарств и антиоксидантов по отдельности или в комбинации против вновь трансформированных шистосомул (NTS) S. mansoni и наблюдали, что несколько комбинаций были более активными, чем только лекарства и антиоксидант [17, 18].Здесь мы оценили эффективность этой новой терапевтической стратегии против взрослых червей S. mansoni in vitro .

3.1. Перепрофилированные препараты, отдельно или в сочетании с антиоксидантными биомолекулами, продемонстрировали интересную антишистосомную активность

Как показано на рисунке 2 и дополнительном рисунке S1, черви контрольной группы (RPMI 1640 с 0,1% ДМСО) оставались жизнеспособными и без морфологических изменений после 72 часов после воздействия . Что касается одних только глистогонных препаратов, PZQ оказался наиболее активным с эффектом (ANOVA) на мужчин и (ANOVA) на женщин.PZQ при 100 μ M вызывал гибель самцов после 24 часов воздействия, в то время как самка осталась жива, но с несколькими морфологическими изменениями через 72 часа (дополнительный рисунок S1 и рисунок 2).

Эти результаты согласуются с теми, которые описаны в литературе, сообщающей, что мужчины более восприимчивы к PZQ, чем женщины [4]. Напротив, самцы были менее восприимчивы к АС, чем самки, как описано в другом месте [22], которые умерли после воздействия в течение 48 часов. Действительно, эффект AS (ANOVA) для женщин и (ANOVA) для мужчин был ниже, чем PZQ (рис. 2).Тем не менее, AS вызывал разъединение через 48 часов воздействия и смерть самки через 72 часа воздействия (дополнительный рисунок S1 и рисунок 2). Что касается активности PZQ и AS против NTS, PZQ вызывал серьезные морфологические изменения в NTS, хотя большинство личинок выжило после 72 часов воздействия, в то время как AS вызывал гибель большинства личинок [17, 18]. Эти данные согласуются с другими, которые показали, что AS более активен против ювенильных форм, в то время как PZQ более активен против взрослых червей [22].Сообщалось о другом антигельминтном препарате, FBZ, который у мышей снижает количество взрослых паразитов S. mansoni [23]. Однако FBZ не повлиял на наши анализы ((ANOVA), рисунок 2) на морфологию самцов, которые оставались жизнеспособными и активными (дополнительный рисунок S1). Самка червя, по-видимому, более восприимчива к лекарственным препаратам, имеющим небольшие морфологические изменения (Рисунок 2 и дополнительный рисунок S1). FBZ более активен против NTS, чем взрослые черви, даже более активен, чем AS или PZQ [17].FBZ может быть полезен на начальной стадии заражения.

Антишистосомная активность противоопухолевых препаратов была более выражена в отношении взрослых глистов, чем глистогонных средств. TMT был наиболее активным ((ANOVA)), за ним следовали VDT ((ANOVA) для мужчин и (ANOVA) для женщин) и IMT ((ANOVA), рисунок 2). VDT и TMT вызывали гибель обоих паразитов после 48 часов воздействия (рис. 2). После инкубации в VDT были очевидны различия в чувствительности самцов и самок; мужчины были более восприимчивы, чем женщины, (ANOVA) и (ANOVA), соответственно (Рисунок 2).IMT вызывал серьезные морфологические изменения, но не гибель паразитов (рис. 2). Тем не менее, разделение червей произошло после 17 часов воздействия. Любопытно, что противораковые препараты также проявляли антишистосомную активность против NTS [18], противодействуя одному из основных недостатков PZQ. Эти противоопухолевые препараты являются ингибиторами киназ, и киназы играют ключевую роль в ключевых физиологических процессах, включая производство яиц [24]. Наблюдаемая антишистосомная активность может быть результатом потенциального ингибирования этих ферментов паразитами.

Из антиоксидантов активными были OXA и Curc, что привело к гибели паразитов обоих полов после 17 часов воздействия, что выражалось в процентах (рис. 2). Эти результаты согласуются с предыдущими выводами [25, 26]. OXA и Curc были более активны, чем сам PZQ (рис. 2), аналогично тому, как это наблюдалось с NTS [18]. Хотя механизм действия этих двух антиоксидантов неясен, OXA может ингибировать тиоредоксин-глутатионредуктазу (TGR) [25], в то время как Curc может мешать пути убиквитин-протеасома [27].Другие сообщения предполагают, что Curc вызывает апоптоз, вызывающий окислительный стресс, и снижает активность антиоксидантных ферментов [28]. Недавно было продемонстрировано, что Curc эффективен не только против S. mansoni , но и против S. haematobium [29]. Что касается других оцениваемых антиоксидантов, Resv, NAC, DiPept и Mel не проявляли антишистосомной активности против взрослых червей, как было отмечено для NTS [18]. Паразиты, инкубированные с этими антиоксидантами, оставались жизнеспособными без каких-либо морфологических изменений во время анализа (рисунок 2; дополнительный рисунок S1).Интересно, что Resv проявляет умеренную антишистосомную активность против NTS [18], в то время как только незначительные морфологические изменения наблюдались в отношении взрослых червей, в основном у самок (Рисунок 2 и дополнительный рисунок S1). С другой стороны, Flav имел минимальный эффект ((ANOVA), рис. 2), вызывая незначительные морфологические изменения, но не гибель паразитов. В этих случаях различия в восприимчивости мужчин и женщин не были очевидны. Напротив, Flav проявляет умеренную антишистосомную активность в отношении NTS [18].Механизм действия этих двух антиоксидантов остается неизвестным, хотя Resv может воздействовать на нейромоторную активность [17, 18], а Flav может модулировать ключевые клеточные ферменты [30]. Необходимы дальнейшие исследования для расшифровки мишеней антиоксидантов и лекарств на взрослых формах S. mansoni .

Здесь мы оценили антишистосомную активность комбинаций антиоксидантов с глистогонными препаратами широкого спектра действия. Антишистосомный эффект в комбинации лекарств с антиоксидантами не отличался от такового, вызванного лекарствами (например,g., TMT + Mel или TMT + Flav) или только антиоксидантами (например, AS + OXA и AS + Curc) (Рисунок 2). Тем не менее, антишистосомная активность, наблюдаемая для комбинаций AS + NAC, AS + DiPept, AS + Flav, AS + Mel, IMT + Flav, FBZ + Flav или Mel и VDT + Resv или Flav, была немного лучше, чем у комбинаций одних только лекарств (рис. 2). . Повышение антишистосомной активности IMT + Flav и VDT + Resv было более выраженным, особенно в отношении женщин (рис. 2). В то время как комбинация VDT + Flav вызывала определенный процент эффекта (ANOVA), одно лекарство оказывает эффект (ANOVA) для мужчин и (ANOVA) для женщин (фиг. 2).

С другой стороны, комбинации PZQ + Resv и AS + Resv, по-видимому, действуют как антагонист, особенно против мужчин. Мужские шистосомы, инкубированные с этими комбинациями, показали лучшую оценку жизнеспособности, чем те, которые содержали только лекарства. Это привело к более высокому проценту эффекта от одного лекарственного средства, чем от комбинаций (рис. 2). Эти комбинации против NTS были классифицированы как синергические [17]. Эти данные могут свидетельствовать о том, что комбинация механизма действия PZQ или AS с Resv может быть более эффективной против NTS, чем взрослых червей.Предположительно, эти комбинации больше подходят для начальной стадии инфекции, чем для хронической инфекции. Напротив, комбинации FBZ + Flav, IMT + Mel или AS + Mel, которые действуют как незначительные или антагонистические по отношению к NTS [18], усиливают антишистосомный эффект по сравнению с отдельными соединениями (рис. 2). Эти данные указывают на то, что стадии развития паразитов проявляют различную восприимчивость, что позволяет предположить, что мишени различны или по-разному экспрессируются на личиночных и взрослых шистосомах.

Также оценивались комбинации двух антиоксидантов. Антиоксиданты, которые проявляли незначительную антишистосомную активность или не проявляли ее при оценке по отдельности, были объединены (рис. 2). В целом эти комбинации не улучшили их антишистосомную активность, большинство из них не проявляют никакой антишистосомной активности (рис. 2). Тем не менее, NAC, DiPept и Mel в сочетании с Flav проявляли умеренную активность ((ANOVA), рисунок 2), особенно в отношении мужчин (например, Flav + NAC и Flav + DiPept). Эти комбинации немного улучшили активность одного Flav, 33.3% по сравнению с (ANOVA), рис. 2. Точно так же два антиоксиданта были более активными, то есть Curc и OXA, когда их объединяли, вызывая немного повышенную активность против взрослых шистосом (рис. 2).

3.2. На яйцекладку явно повлияли антиоксиданты, применяемые отдельно или в сочетании с лекарствами.

Хронический шистосомоз является следствием непрерывного отложения яиц, которое вызывает воспаление, фиброз, портальную гипертензию и проявления заболеваний, специфичных для кишечных и тазовых органов [31]. Фекальные выделения и выделения яиц с мочой также являются показателем жизнеспособности глистов.Таким образом, откладка яиц может быть важной целью для разработки новых подходов к лечению шистосомоза [32]. Репродуктивная способность паразитов основана на двух основных критериях: спаривании и яйценоскости. Первые указывают на то, происходит ли процесс спаривания, а вторые — показатель яйценоскости [33]. Хотя некоторые соединения по отдельности или в сочетании не вызывают гибель паразитов, они могут предотвратить откладывание яиц, что может иметь решающее значение для противодействия патологиям, связанным с инфекцией (дополнительная таблица S1 и рисунок 3).Все препараты, проверенные против взрослых червей, останавливали откладывание яиц шистосомами либо за счет их гибели (например, PZQ), либо за счет разделения (например, AS). Примечательно, что в то время как FBZ не вызывала серьезных морфологических изменений или разделения, это привело к прекращению откладки яиц, что свидетельствует о поражении репродуктивной системы самки. Действительно, процент антишистосомного эффекта FBZ был более выражен у женщин, чем у мужчин (рис. 2).

Что касается антиоксидантов, только OXA, Curc, Flav и Resv также препятствовали откладке яиц (рис. 3).В случае OXA и Curc это произошло из-за гибели паразитов. С другой стороны, как и FBZ, Flav и Resv не вызывали серьезных морфологических изменений или гибели паразитов (рис. 2), но черви перестали выделять яйца (рис. 3). Хотя эти антиоксиданты не вызывали серьезных морфологических изменений у взрослых червей, вызванных прекращением откладки яиц. Это важный факт, поскольку высвобождение яиц паразитами связано с образованием гранулемы и воспалением, связанным с шистосомозом, поэтому может иметь решающее значение для противодействия патологиям, связанным с инфекцией.Механизм действия этих антиоксидантов против шистосом еще предстоит определить. Тем не менее, это может относиться к дегенеративному процессу женской репродуктивной системы, по крайней мере in vitro . Напротив, другие оцениваемые антиоксиданты (DiPept и NAC) не влияли на кладку яиц и не вызывали морфологических изменений (рис. 2 и 3), что свидетельствует о том, что они не проявляют антишистосомную активность. Однако все комбинации глистогонных препаратов с антиоксидантами также приводили к прекращению откладки яиц, как и при использовании одних соединений.Это может быть связано с активностью только лекарств или антиоксиданта, то есть Flav и OXA, а не их комбинации.

В комбинациях антиоксидант и антиоксидант прекращение откладки яиц происходило только тогда, когда Flav сочетался с другими антиоксидантами (рис. 3), что могло быть связано с антишистосомальной активностью Flav. Другие оцениваемые комбинации, например, Mel + DiPept, Mel + NAC или NAC + DiPept, не повлияли на откладку яиц. Как уже отмечалось, эти антиоксиданты не вызывали каких-либо морфологических изменений, которые соответствовали бы продолжению откладки яиц во время анализа.

4. Выводы

Мы сообщаем об эффекте нескольких классов антигельминтных препаратов и антиоксидантных биомолекул по отдельности или в сочетании против взрослых червей S. mansoni . Не только антиоксиданты (например, OXA и Curc) были активны против взрослых глистов, но также некоторые комбинации (например, глистогонные препараты плюс антиоксидант или антиоксидант плюс антиоксидант) усиливали антишистосомную активность. Тем не менее, результаты, относящиеся к Curc, следует интерпретировать осторожно, поскольку этот антиоксидант считается нестабильным, и неясно, связана ли его активность с лекарственным механизмом или косвенными эффектами [34, 35].Повышенная активность может быть связана с различными способами их действия и / или мишенями для взрослых паразитов. Поскольку яйца шистосом являются очагом воспалительного процесса при шистосомозе [31] и участвуют в канцерогенезе мочевого пузыря во время инфицирования S. haematobium [11], может быть полезно нацелить откладывание яиц в антигельминтной терапии. Действительно, комбинация различных активных агентов, оцененная в ходе этого исследования, вызвала прекращение откладки яиц, по крайней мере, in vitro .Рассматриваемые вместе с предыдущими результатами с NTS [18], эти настоящие результаты показывают, что перепрофилирование противоопухолевых препаратов (или других) может быть целесообразным, поскольку они были активны как на личиночных, так и на взрослых шистосомах [18]. Кроме того, благодаря своим биологическим свойствам антиоксидантов в предотвращении повреждения ДНК и блокировании процесса инициации рака [14, 15], они могут быть полезны для облегчения последствий заболевания, в том числе для предотвращения канцерогенеза при урогенитальном шистосомозе [11, 17].Дальнейшие исследования с использованием лучших антиоксидантов (оксадиазола и куркумина) в сочетании с лекарствами должны быть оценены как in vivo .

Доступность данных

Все данные (структура лекарств, оценка жизнеспособности, влияние лекарств на яйцекладку и морфологические изменения глистов), использованные для подтверждения результатов этого исследования, включены в статью и дополнительный информационный файл.

Раскрытие информации

Часть этого исследования была опубликована в качестве доктора философии. диссертация Марии Жоао Гувейя (декабрь 2019 г., Университет Порту).Авторы несут полную ответственность за содержание этого отчета, и оно не обязательно отражает официальную точку зрения FCT или NIH.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Вклад авторов

M.J.G. и Н.В. задумали и спланировали эксперименты. M.J.G. и Н.В. проводили эксперименты. M.J.G. и N.V. спланировали и провели моделирование. M.J.Г. участвовал в пробоподготовке. M.J.G., P.B., F.G. и N.V. внесли свой вклад в интерпретацию результатов. M.J.G. и Н.В. взяли на себя инициативу в написании рукописи. Все авторы предоставили критические отзывы и помогли сформировать исследование, анализ и рукопись.

Благодарности

Мы выражаем нашу глубочайшую признательность Марии Лурдес Дельгадо за квалифицированное обслуживание жизненного цикла шистосом и ее техническую поддержку. NV благодарит Fundação para Ciência e a Tecnologia (FCT).PJB выражает признательность за поддержку премии CA164719 Национального института рака (NCI), Национальных институтов здоровья (NIH), США. Эта работа финансировалась региональными фондами FEDER-Fundo Europeu de Desenvolvimento через Оперативную программу конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020 (POCI), Portugal 2020, и португальскими фондами через FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia. Эта статья была поддержана национальными фондами через FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.в CINTESIS, R&D Unit (ссылка UIDB / 4255/2020). FCT и FEDER (Европейский Союз) также поддержали эти исследования через номер проекта IF / 00092/2014 / CP1255 / CT0004.

Дополнительные материалы

Таблица S1: откладка яиц, выраженная как среднее количество отложенных яиц на одного червя в ходе анализа in vitro . Рисунок S1: репрезентативные микрофотографии взрослых червей после 72 часов воздействия антигельминтных препаратов (празиквантел (PZQ), артесунат (AS) и флубендазол (FBZ)), противоопухолевых препаратов (иматиниб (IMT), траметиниб (TMT) и вандетаниб ( VDT)), антиоксиданты (4-фенил-1,2,5-оксадиазол-3-карбонил, 2-оксид (OXA), N-ацетилцистеин (NAC), ресвератрол (Resv), флавон (Flav), H-Trp- Ser-OH (DiPept) и мелатонин (Mel)) по отдельности и в сочетании (1: 1) при 100 μ M.Оценка жизнеспособности, полученная в течение 72 часов после контакта с соединениями по отдельности или в сочетании. (Дополнительные материалы)

Frontiers | Переназначение глистогонного никлозамида для лечения лейкемии с множественной лекарственной устойчивостью

Введение

Никлозамид, глистогонный препарат, который используется около 50 лет, безопасен и хорошо переносится. Никлозамид был идентифицирован как потенциальный противораковый агент, который проявляет цитотоксическую и цитостатическую активность против широкого спектра типов рака, включая лейкоз, рак груди, рак простаты, гепатоцеллюлярную карциному и глиобластому.Кроме того, он показал противоинвазивные и противомиграционные эффекты. Несколько сигнальных путей ингибируются никлозамидом в раковых клетках, включая Wnt / β-катенин, механистическую мишень комплекса рапамицина 1 (mTORC1), преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3), ядерный фактор, каппа-легкая цепь-энхансер активированного В-клетки (NF-κB) и пути Notch (Li et al., 2014).

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) — серьезная проблема у онкологических больных, которая приводит к неэффективности химиотерапии.Он влияет на большинство видов рака и характеризуется перекрестной устойчивостью к широкому спектру широко используемых химиотерапевтических препаратов (Bartsevich and Juliano, 2000). Большинство видов рака состоят из смеси разнородных злокачественных клеток. Некоторые из них чувствительны к лекарствам, а другие — к лекарствам. В результате химиотерапевтические агенты в основном убивают чувствительные клетки, но не учитывают большую часть популяций устойчивых клеток. Следовательно, рецидивирующие опухоли часто оказываются резистентными с фатальными последствиями для пациентов (Housman et al., 2014). Из различных механизмов, которые вносят вклад в развитие МЛУ при раке, чаще всего встречается усиленный отток лекарств переносчиками АТФ-связывающей кассеты (ABC). Наиболее важным из этих переносчиков является Р-гликопротеин (Pgp; Bellamy, 1996).

Повышенные уровни активных форм кислорода (АФК) встречаются почти при всех типах рака. Они участвуют в стимулировании развития и прогрессирования опухоли (Storz, 2005). Раковые клетки также экспрессируют повышенный уровень антиоксидантов для детоксикации АФК.Процесс детоксикации АФК облегчается либо за счет антиоксидантных ферментов, которые удаляют различные типы АФК, либо за счет неферментативных молекул. Антиоксидантные ферменты включают каталазу, супероксиддисмутазу и пероксиредоксины. Неферментные антиоксиданты включают глутатион (GSH), флавоноиды, витамины A, C и E (Liou and Storz, 2010). Обработка раковых клеток витамином Е и витамином С (поглотителями АФК) увеличивала экспрессию Pgp. Это говорит о том, что Pgp-опосредованная МЛУ можно обойти в условиях повышенных уровней АФК.Одним из соединений, повышающих уровень АФК в раковых клетках, является никлозамид. Генерация АФК играет важную роль в противоопухолевой активности никлозамида в клетках острого миелоидного лейкоза и рака легких (Wartenberg et al., 2005; Jin et al., 2010; Lee et al., 2014).

Конечная цель разработки лекарств — идентифицировать молекулы с желаемым эффектом в организме человека и установить их качество, безопасность и эффективность для лечения пациентов (Kraljevic et al., 2004). Разработка лекарств, начиная с первоначального открытия многообещающей мишени для конечного лекарственного средства, поступающего на рынок, — это дорогостоящий, длительный и постепенный процесс (Hoelder et al., 2012). Альтернативный подход — это перепозиционирование или перепрофилирование лекарств, при котором обнаруживаются новые показания для существующих лекарств. Преимущества этого подхода в том, что фармакокинетика, фармакодинамика и профили токсичности исследуемых препаратов уже известны. В случае успеха это приводит к значительному сокращению временных и денежных затрат на оценку лекарств во время доклинических и клинических разработок (Ashburn and Thor, 2004; Tada et al., 2006).

Чтобы оценить полезность никлозамида для лечения МЛУ, мы исследовали его активность в отношении чувствительных клеток лейкемии CCRF-CEM и MDR (сверхэкспрессия Pgp) CEM / ADR5000.Поскольку известно, что никлозамид повышает уровень АФК в раковых клетках, мы также проверили его влияние на образование АФК в обеих клеточных линиях. Кроме того, мы попытались определить молекулярные механизмы действия никлозамида с помощью анализа на основе микрочипов.

Материалы и методы

Сотовый телефон

Клетки лейкемии

CCRF-CEM и CEM / ADR5000, множественной миеломы RPMI-8226 и колоректального рака HT-29 выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 Ед / мл) / стрептомицина ( 100 мкг / мл) в атмосфере 5% CO ₂ при 37 ° C.MDA-MB-231 клетки рака молочной железы и клетки рака легких A549 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 Ед / мл) / стрептомицина (100 мкг / мл) в атмосфере 5% CO ₂ при 37 ° С. Клетки пассировали дважды в неделю. Устойчивость CEM / ADR5000 поддерживалась обработкой 5000 нг / мл доксорубицина в течение 24 часов каждые 2 недели. Все эксперименты проводились с клетками в логарифмической фазе роста.

Анализ цитотоксичности

Клетки, полученные из культур экспоненциальной фазы, подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты.Плотность посева составляла 10 ⁴ клеток на лунку для обеих клеточных линий. Затем клетки обрабатывали никлозамидом (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия), используя 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 мкМ во всех клеточных линиях. После 72-часового инкубационного периода в каждую лунку добавляли 20 мкл резазурина 0,01% масс. / Об. И планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Флуоресценцию измеряли с помощью планшет-ридера Infinite M2000 Pro (Tecan, Crailsheim, Германия). Кривые «доза-ответ» строили путем построения графика средней жизнеспособности клеток (%) в зависимости от концентрации соединения (мкМ).Значения IC ₅₀ рассчитывали по калибровочной кривой с помощью линейной регрессии с использованием Microsoft Excel. Соотношение резистентности для чувствительных клеток CCRF-CEM и устойчивых клеток CEM / ADR5000 рассчитывали по формуле: IC _{50 устойчивых} / IC _{50 чувствительных} . Опыты повторяли трижды.

Анализ ROS

Для каждого образца 2 × 10 ⁶ клеток высевали в каждую лунку шестилуночного планшета. Каждую лунку обрабатывали 1,5 мкМ никлозамида или диметилсульфоксида (ДМСО).После 24-часовой инкубации клетки центрифугировали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640 и инкубировали с 10 мкМ 2 ‘, 7’-дихлородигидрофлуоресцеиндиацетатом (H ₂ DCFH-DA) в течение 20 минут в темноте. Затем клетки центрифугировали, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), ресуспендировали в культуральной среде и измеряли в проточном цитометре BD-C6 (Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany). Клетки также обрабатывали H ₂ O ₂ в течение 15 минут в качестве положительного контроля. Для каждого образца было подсчитано 1 × 10 ⁴ клеток.2 ‘, 7’-дихлорфлуоресцеин (DCF) измеряли при возбуждении 488 нм и детектировали с использованием полосового фильтра 530/30 нм. Эксперимент был повторен три раза.

Прогнозирование цели

Структура никлозамида была получена из ChemSpider и сохранена как файл mol. Затем соединение вводили в программу DRAR-CPI. Были получены белковые мишени, показавшие самые высокие баллы стыковки.

Анализ глутатиона

Уровни GSH определяли после обработки клеток 0.75, 1,5, 3, 6 и 12 мкМ никлозамида и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C. Затем клетки центрифугировали и суспендировали в PBS с добавлением 5% FBS. Клетки окрашивали 40 мкМ монохлорбимана и инкубировали 20 мин. Флуоресценцию считывали с помощью проточного цитометра LSR-Fortessa (Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany) с использованием лазера 405 нм. Эксперимент был повторен три раза.

Молекулярная стыковка

PDB-файл для кристаллической структуры GSH-синтетазы (GS) (PDB ID: 2HGS) был загружен из банка данных по белкам.Чтобы выполнить молекулярный докинг, белковая структура GS была сначала обработана с помощью AutodockTools-1.5.6rc316, чтобы преодолеть проблемы неполных структур из-за отсутствия атомов или воды и присутствия мультимеров или партнеров по взаимодействию молекулы рецептора. Выходной файл после подготовки был установлен в формате PDBQT, куда добавлялась информация о парциальных зарядах атомов, степенях свободы кручения и различных типах атомов, например, алифатических и ароматических атомах углерода или полярных атомах, образующих водородные связи.Затем была построена сетка для определения стыковочных пространств. Размеры сеточного бокса устанавливались вокруг всей белковой молекулы таким образом, чтобы лиганд мог свободно перемещаться и вращаться в стыковочном пространстве. Блок сетки состоял из 126 точек сетки во всех трех измерениях (X, Y и Z), разделенных расстоянием 1 Å между каждым из них. Энергии в каждой точке сетки оценивали для каждого типа атома, присутствующего в лиганде, и значения использовали для прогнозирования энергии конкретной конфигурации лиганда.Параметры стыковки были установлены на 250 запусков и 2 500 000 оценок энергии для каждого цикла. Докинг был выполнен для никлозамида на GS с использованием Autodock4 с помощью алгоритма Ламарка. Соответствующие энергии связи и количество конформаций в каждом кластере были получены из файлов журнала стыковки (dlg). Процесс повторяли в трех экземплярах. Были рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение.

Микромасштабный термофорез

Взаимодействие между рекомбинантным GS человека (Abcam, Кембридж, Великобритания) и никлозамидом изучали с помощью термофореза на микромасштабах, как описано ранее (Seo and Efferth, 2016).Белок метили в соответствии с набором для маркировки белков Monolith ^TM NT.115 BLUE-NHS (реагирующий с амином; NanoTemper Technologies GmbH, Мюнхен, Германия). Меченый GS человека титровали никлозамидом. Конечные концентрации никлозамида составляли 200, 100, 50, 25 и 3,125 мкМ в буфере для анализа (50 мМ Трис-буфер pH 7,6, содержащий 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ и 0,05% Твин-20). Образцы анализировали с использованием гидрофильных капилляров в NanoTemper Monolith ^TM NT (NanoTemper Technologies GmbH, Мюнхен, Германия) на предмет флуоресценции синего красителя.

СРАВНИТЬ Анализы

Использовали данные микроматрицы мРНК панели линий опухолевых клеток NCI, доступные на веб-сайте NCI (Scherf et al., 2000; Staunton et al., 2001). Анализы COMPARE были выполнены для получения упорядоченных по порядку списков генов, экспрессируемых в клеточных линиях NCI, как описано ранее (Paull et al., 1989; Wosikowski et al., 1997). Вкратце, каждый ген из базы данных микрочипов NCI был ранжирован по сходству его экспрессии мРНК со значениями log ₁₀ IC ₅₀ для никлозамида.Для получения рейтинга COMPARE был создан масштабный индекс коэффициентов корреляции ( R -значений).

Иерархический кластерный анализ

Иерархический кластерный анализ был выполнен, чтобы создать кластерную модель для различных клеточных линий. Это было сделано путем классификации объектов по дендрограммам. Расстояния рассчитывались исходя из близости расстояний между индивидуумами. Кластерные модели ранее были проверены для профилирования экспрессии генов и для приближения к молекулярной фармакологии противоопухолевых агентов (Efferth et al., 1997; Scherf et al., 2000).

Анализ мотива связывания промотора

Связывающие мотивы для факторов транскрипции в промоторных последовательностях генов анализировали с помощью программного обеспечения для анализа Cistrome (Liu et al., 2011). Вкратце, интересующие гены были получены в формате BED из https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables. SeqPos использовали для скрининга на наличие мотивов связывания обогащенных факторов транскрипции в промоторных последовательностях генов. Скрининг был выполнен для мотивов, депонированных в базах данных Transfac, JASPAR, UniPROBE и PDI.Более того, de novo мотивов были идентифицированы с помощью алгоритма MDscan.

Ядерный фактор активированных Т-клеток Репортерный анализ

клеточных линий HEK293 трансфицировали ядерным фактором репортерной конструкции активированных Т-клеток (NFAT) -люцифераза (Qiagen, Germantown, MD, США). Клетки культивировали в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки обрабатывали никлозамидом в различных концентрациях в течение 24 часов. Активность промотора NFAT количественно оценивали с помощью системы анализа репортеров с двойной люциферазой (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) путем измерения люминесценции люциферазы светлячка и рениллы на планшет-ридере Infinite M2000 Pro ^TM (Tecan).Отношение интенсивности люциферазы светлячка к интенсивности люциферазы рениллы дает меру активности NFAT. Относительную яркость для каждого образца рассчитывали как: люминесценция люциферазы светлячка / люминесценция люциферазы renilla. Обработка ДМСО служила контролем. Нормализованную активность NFAT рассчитывали по формуле: относительная люцифераза образца / относительная люцифераза контроля ДМСО. Эксперимент был повторен три раза.

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых тестов.Статистическую значимость определяли с использованием критерия Стьюдента t . Значение p менее 0,05 означает значимость во всех случаях. Иерархический кластерный анализ выполняли с использованием метода Уорда (программа WinSTAT, Kalmia, Кембридж, Массачусетс, США).

Результаты

Анализ цитотоксичности

Цитотоксическая активность никлозамида была протестирована на лейкемии CCRF-CEM и CEM / ADR5000, множественной миеломе RPMI-8226, колоректальном раке HT-29, раке молочной железы MDA-MB-231 и клетках рака легких A549 с использованием анализа резазурина.Никлозамид проявлял различную активность в отношении тестируемых клеточных линий, как показано на рисунке 1. Он был наиболее активен в отношении линий гематологических раковых клеток CCRF-CEM, CEM / ADR5000 и RPMI-8226 по сравнению с линиями солидных опухолевых клеток HT-29, MDA. -MB-231 и A549. Отношение резистентности между чувствительными CCRF-CEM и мультирезистентными клетками CEM / ADR5000 составляло 1,24, что указывает на то, что CEM / ADR5000 были чувствительны к никлозамиду.

РИСУНОК 1. Кривые доза-ответ из анализов цитотоксичности (A) линий гематологических раковых клеток (CCRF-CEM, CEM / ADR5000 и RPMI-8226) и (B) линий солидных опухолевых клеток (HT -29, MDA-MB-231 и A549).

Анализ ROS

Уровни АФК в клетках анализировали после обработки никлозамидом с помощью окрашивания H ₂ DCFH-DA и проточной цитометрии. Четкое дозозависимое увеличение клеточных уровней АФК наблюдалось после 24 ч инкубации с никлозамидом (рис. 2). Таким образом, никлозамид можно рассматривать как индуктор АФК в клетках острого лимфобластного лейкоза.

РИСУНОК 2. Влияние 24-часовой обработки никлозамидом (1,5 мкМ) на уровни ROS в клетках CCRF-CEM и CEM / ADR5000. H ₂ O ₂ (50 мкМ) использовали в качестве положительного контроля ( ^∗ p <0,05, ^∗∗ p <0,01 по сравнению с обработанными ДМСО контрольными клетками).

Прогнозирование цели

Всего с помощью алгоритма DRAR-CPI была идентифицирована 391 биологическая мишень для никлозамида. Интересно, что GS, который непосредственно участвует в метаболизме ROS, был среди предполагаемых мишеней. Никлозамид показал оценку стыковки -47,8 и оценку Z ′, равную -0.788 для GS. Поэтому мы предположили, что связывание никлозамида с GS и последующее ингибирование продукции GSH играет важную роль в увеличении ROS после обработки клеток.

Анализ глутатиона

Чтобы проверить, влияет ли никлозамид на уровни GSH в чувствительных и устойчивых клеточных линиях, анализы GSH проводили после обработки лейкозных клеток различными концентрациями никлозамида. Клетки окрашивали монохлорбиманом и измеряли флуоресценцию с помощью проточной цитометрии.Как показано на фиг. 3, никлозамид значительно снижал внутриклеточные уровни GSH дозозависимым образом в обеих клеточных линиях. Однако эффект на чувствительные клетки CCRF-CEM был немного выше, чем эффект на устойчивые клетки CEM / ADR5000, что согласуется с результатами анализа ROS.

РИСУНОК 3. Влияние никлозамида на уровни глутатиона в клетках CCRF-CEM и CEM / ADR5000. (A) Проточный цитометрический анализ уровней глутатиона после обработки никлозамидом (12 мкМ) в течение 24 часов. (B) Статистическая количественная оценка уровней глутатиона после обработки разными концентрациями никлозамида ( ^∗ p <0,05, ^∗∗ p <0,01 по сравнению с обработанными ДМСО контрольными клетками).

Молекулярная стыковка

Чтобы предсказать сродство связывания никлозамида с GS и предложить его сайт связывания, мы выполнили молекулярный докинг. Белковая структура GS была загружена в формате PDB, обработана с помощью Autodock Tools и окончательно преобразована в формат PDBQT.Затем была построена сетка. Затем оценивали энергии в каждой точке сетки для каждого типа атомов, присутствующих в лиганде. Значения были использованы для прогнозирования энергии конкретной конфигурации лиганда. Докинг был выполнен для никлозамида на GS с помощью Autodock4 с использованием алгоритма Ламарка. Соответствующие энергии связи и количество конформаций в каждом кластере были получены из файлов журнала стыковки (dlg). Как показано на рисунке 4, самая низкая энергия связи для никлозамида на GS была предсказана как -9.40 ± 0,01 ккал / моль, что является довольно низким значением. Аминокислоты, участвующие во взаимодействии, включали Ile143, Asn373, Tyr375, Met398, Glu399, Ile401, Arg450, Lys452 и Ala457. Две аминокислоты (Arg450 и Ala457) показали взаимодействие с водородными связями.

РИСУНОК 4. Связывание никлозамида в АТФ-связывающем домене глутатионсинтетазы (GS). Аминокислоты, образующие водородную связь, показаны красным.

Микромасштабный термофорез

Микромасштабный термофорез

был использован для анализа прямого взаимодействия между GS и никлозамидом (рис. 5).Этот метод используется для определения аффинности связывания между флуоресцентно меченным белком и немеченым соединением. Меченый GS титровали с разными концентрациями никлозамида. Константа равновесного связывания 5,64 мкМ была получена, что свидетельствует о прямом связывании GS с никлозамидом.

РИСУНОК 5. Характеристика аффинности связывания GS, меченного никлозамидом, с использованием термофореза на микромасштабах.

Анализ микрочипов

Чтобы сопоставить клеточные ответы никлозамида с экспрессией дерегулированных генов, мы провели сравнительный анализ.Используя базу данных NCI, мы коррелировали экспрессию мРНК транскриптома на основе микроматрицы 60 линий опухолевых клеток со значениями log ₁₀ IC ₅₀ для никлозамида. Мы провели стандартное сравнение, которое коррелировало самые низкие значения IC ₅₀ с самыми низкими уровнями экспрессии мРНК генов. Затем мы провели обратное СРАВНЕНИЕ, которое коррелировало самые низкие значения IC ₅₀ с наивысшим уровнем экспрессии гена. Порог для коэффициентов корреляции составил R > 0.55 для стандартного СРАВНЕНИЯ и R <-0,55 для обратного СРАВНЕНИЯ (Дополнительная таблица S1). Гены, которые показали хорошую корреляцию с чувствительностью к никлозамиду, включали гены, участвующие в передаче сигнала ( TP53INP2, LAMTOP5, PDE6G ), метаболизме липидов ( SOAT, GMA2 ), регуляции роста и развития клеток ( MAP6, TANC2 ) и другие. С другой стороны, гены, которые коррелировали с устойчивостью, включали гены, участвующие в передаче сигнала ( MUC13, S100P, ARHGEF5, LMO7 ), липидном метаболизме и транспорте ( PLA2G2A, CYP3A4, APOM ), синтезе белка ( RPS16, E1F2S2 ) и другие.Значения экспрессии мРНК этих генов использовали для проведения иерархического кластерного анализа. Дендрограмму этого кластерного анализа можно разделить на пять основных ветвей кластера (рис. 6). Чувствительность или устойчивость к никлозамиду и его производным предсказывали по распределению клеточных линий на дендрограмме в соответствии с профилями экспрессии их генов. Мы обнаружили значительную разницу в распределении линий чувствительных и устойчивых клеток между ветвями дендрограммы ( p = 8.66 × 10 ^-5 ). Следовательно, ответ этой панели клеточных линий на никлозамид и его производное можно определить по профилю экспрессии гена.

РИСУНОК 6. Дендрограмма иерархического кластерного анализа (метод Уорда), полученная на основе микроматричных профилей экспрессии мРНК генов, полученных из базы данных NCI, коррелирующих с никлозамидом.

Анализ мотивов связывания промотора

Для дальнейшего определения факторов транскрипции и сигнальных путей, участвующих в противораковой активности никлозамида, мы выполнили анализ мотива связывания промотора.Для этого был выбран набор из 30 дерегулированных генов из данных микрочипа. Как показано в таблице 1, несколько факторов транскрипции могут участвовать в клеточном ответе раковых клеток на никлозамид. Среди них были CEBPA и CEBPB (регуляция клеточного цикла), RELA и CREL (путь NF-κB), TCF7L1 (путь передачи сигналов Wnt / β-катенин), фактор роста SMAD3 [ бета (TGF-β) передача сигналов], FOXO1 и NFAT , все из которых участвуют в инициации и прогрессировании рака.

ТАБЛИЦА 1. Факторы транскрипции, промоторные мотивы которых обнаружены в генах, идентифицированных с помощью сравнительного анализа.

Репортерный анализ NFAT

NFAT был среди факторов транскрипции, которые потенциально могут связываться с промоторами генов с нарушенной регуляцией генов по данным микрочипа. Чтобы подтвердить этот вывод, мы провели репортерный анализ NFAT. Как показано на Фигуре 7, никлозамид действительно вызывал значительное снижение активности NFAT дозозависимым образом.

РИСУНОК 7. Влияние 24-часовой обработки никлозамидом в различных концентрациях на сигнальную активность NFAT. Показанные результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов ( ^* p <0,01 по сравнению с обработанными ДМСО контрольными клетками).

Обсуждение

Серьезной проблемой противоопухолевой терапии является развитие МЛУ. Pgp, энергозависимый оттокный насос, играет важную роль в развитии МЛУ.Клинические исследования показали, что сверхэкспрессия Pgp в раковых клетках связана с плохим прогнозом (Bellamy, 1996). Этот белок транспортирует химиотерапевтические препараты, которые играют центральную роль во многих противоопухолевых схемах (Allen et al., 2000). Никлозамид показал цитотоксические эффекты против различных типов рака (Li et al., 2014). Результаты нашего анализа цитотоксичности на линиях клеток гематологического рака, рака груди, легких и колоректального рака показали, что никлозамид более активен против трех гематологических клеточных линий по сравнению с клеточными линиями солидных опухолевых клеток, которые были более устойчивыми.Однако, насколько нам известно, влияние никлозамида на рак с множественной лекарственной устойчивостью до сих пор не исследовалось. Интересно, что мы обнаружили, что никлозамид активен как против чувствительных, так и против лейкозных клеток с избыточной экспрессией Pgp. Было обнаружено, что коэффициент устойчивости составляет 1,24, что указывает на то, что никлозамид проявляет значительную цитотоксическую активность против лейкозных клеток, которые проявляют фенотип MDR. Причина может быть связана с его быстрым захватом и эффективным обходом Pgp, что приводит к его более высокому внутриклеточному накоплению и эффективности.Насколько нам известно, мы впервые сообщаем, что никлозамид активен против раковых клеток с множественной лекарственной устойчивостью.

АФК — это химические соединения с высокой реакционной способностью, включая радикалы, ионы или молекулы, которые имеют единственный неспаренный электрон во внешней оболочке электронов (Liou and Storz, 2010). Использование агентов, которые значительно увеличивают АФК, представляет собой эффективную стратегию уничтожения раковых клеток. Таким образом, общий подход к лечению рака представляет собой применение агентов с сильными прооксидантными свойствами.Такие агенты будут либо непосредственно генерировать АФК, либо ингибировать антиоксидантные системы в клетке. Это приведет к повышению уровня АФК выше порогового значения с последующей индукцией апоптоза и гибели клеток (Иванова и др., 2013). Известно, что никлозамид увеличивает уровень АФК в раковых клетках, включая острый миелоидный лейкоз и клетки рака легких (Wartenberg et al., 2005; Jin et al., 2010; Lee et al., 2014; Liao et al., 2015). Однако механизм этого эффекта ранее не исследовался.Наши результаты показали, что никлозамид также вызывает повышение уровней АФК как в чувствительных, так и в клетках лейкемии с множественной лекарственной устойчивостью. Пытаясь выяснить механизм повышения уровня АФК никлозамидом, мы определили GS как возможную мишень никлозамида. GS играет ключевую роль в синтезе GSH, поскольку он катализирует образование GSH из γ-глутамилцистеина и глицина и, следовательно, определяет общую синтетическую способность GSH в некоторых тканях, особенно в стрессовых условиях (Lu, 2013).GSH — один из важнейших антиоксидантов клетки. Он играет несколько жизненно важных ролей, включая поддержание окислительно-восстановительного состояния, детоксикацию лекарств и защиту клеток от повреждения свободными радикалами, пероксидами и токсинами (Singh et al., 2012). Он участвует в репарации ДНК и апоптозе (Ichijo et al., 1997; Izbicka et al., 1997; Harwaldt et al., 2002) и явно связан с устойчивостью рака к химиотерапевтическим агентам (Capron et al., 2001; Harwaldt et al., 2002). Следовательно, никлозамид должен снижать уровень GSH в раковых клетках.Соответственно, мы измерили уровни GSH в лейкозных клетках после лечения разными концентрациями никлозамида. Значительное снижение уровня GSH указывает на подавление синтеза GSH. Поскольку известно, что GSH участвует в развитии лекарственной устойчивости (Townsend and Tew, 2003), ингибирование его синтеза, вероятно, играет роль в активности никлозамида в отношении клеток с множественной лекарственной устойчивостью.

Молекулярный докинг был использован для подтверждения и уточнения ингибирующего действия никлозамида на GS. Этот биоинформатический инструмент считается важным и ценным при открытии и разработке лекарств.Его ценность заключается в его способности предсказывать конформацию низкомолекулярных лигандов в пределах соответствующего сайта связывания мишени. Он также оценивает свободную энергию связывания рецептора лиганда, участвующую в молекулярном взаимодействии (Meng et al., 2011). Никлозамид дает низкую энергию связи, что указывает на высокое сродство к GS. Чтобы подтвердить результат молекулярного докинга, мы изучили реальное взаимодействие между GS и никлозамидом с помощью термофореза на микромасштабах. Результаты показали хорошее сродство связывания, что подтверждает наши выводы.Таким образом, мы можем предположить, что никлозамид является возможным ингибитором GS. Следовательно, ожидается, что никлозамид подавляет синтез GSH в раковых клетках, вызывая снижение уровней GSH, показанное с помощью анализов GSH. Затем это приводит к снижению эффектов GSH по улавливанию ROS, вызывая повышенное накопление ROS в раковых клетках. Кристаллографическое исследование взаимодействия GS с АТФ показало, что Ile143, Tyr375, Met398, Glu399, Ile401 и Lys452 вносят вклад во взаимодействие между GS и ATP (Полехина и др., 1999; Динеску и др., 2004). Соответственно, никлозамид ингибирует активность GS путем конкурентного связывания с сайтом связывания АТФ и, следовательно, блокирует взаимодействие с АТФ. Интересно, что ингибиторы GS не были описаны в предыдущих исследованиях. Таким образом, никлозамид является первым соединением, вызывающим ингибирование GS.

Гены, идентифицированные с помощью анализа COMPARE на основе микрочипов, которые показали хорошую корреляцию с клеточным ответом на никлозамид, включали гены, участвующие в метаболизме липидов, передаче сигнала, регуляции роста и развития клеток, синтезе белка и другие.Результат иерархического кластерного анализа показал значительную разницу в распределении чувствительных и устойчивых клеточных линий между ветвями дендрограммы. Следовательно, ответ этой панели клеточных линий на никлозамид можно определить по профилю экспрессии гена. Ингибиторы липогенных ферментов — довольно активные и эффективные противоопухолевые средства. Некоторые другие соединения, которые нацелены на метаболизм и гомеостаз липидов и холестерина, показали соответствующую противораковую активность (Beloribi-Djefaflia et al., 2016). Согласно нашим результатам анализа данных микроматрицы, метаболизм липидов может играть центральную роль в цитотоксической активности никлозамида против раковых клеток. Для подтверждения этого механизма действия необходимы дальнейшие исследования. Сюда входит определение влияния никлозамида на уровни липогенных ферментов и на количество общих липидов, общего холестерина и триглицеридов в раковых клетках. Стоит отметить, что ни один из переносчиков ABC не был связан с устойчивостью к никлозамиду.Это согласуется с нашим открытием, что сверхэкспрессия Pgp не участвует в устойчивости к никлозамиду. Анализ мотивов связывания промотора данных микроматрицы никлозамида показал, что ряд факторов транскрипции потенциально может связываться с промоторами этих генов. Те, которые связаны с раком, включают CEBPA, CEBPB, RELA, CREL, TCF7L1, NFAT и SMAD3 . Таким образом, в противораковую активность никлозамида вовлечены несколько сигнальных путей. Эти пути включают пути передачи сигналов NF-κB, Wnt, NFAT, TGF-β и белок O (FOXO).Кроме того, факторы транскрипции CCAAT / энхансер-связывающий белок (CEBP), участвующие в регуляции клеточного цикла, также могут играть роль в активности никлозамида. Согласно нашим данным, никлозамид, как известно, проявляет противораковую активность посредством ингибирования сигнальных путей NF-κB и Wnt (Li et al., 2014). Также известно, что никлозамид ингибирует механистическую мишень передачи сигналов рапамицина (mTOR) (Fonseca et al., 2012). Путь передачи сигналов mTOR регулирует активность FOXO, а также передачу сигналов TGF-β (Mori et al., 2014; Ю. и др., 2015). Кроме того, он контролирует соотношение экспрессии изоформы CEBP. Следовательно, возможно, что действие никлозамида на экспрессию регулируемых генов FOXO, TGF-β и CEBP происходит через ингибирование передачи сигналов mTOR.

Ранее было исследовано влияние никлозамида на несколько сигнальных путей (Li et al., 2014). Хотя его влияние на активность NFAT еще не изучено. Сигнальный путь NFAT играет важную роль в развитии и функционировании иммунной системы.Он также участвует в развитии сердечной, скелетной мускулатуры и нервной системы. Этот путь активируется повышением уровня кальция в результате его высвобождения из эндоплазматического ретикулума или его притока через активированные каналы в клеточной мембране. Недавние открытия показали, что NFAT способствует развитию и прогрессированию рака, включая солидные опухоли и гематологические злокачественные новообразования. Также известно, что передача сигналов NFAT постоянно активна в мышиных моделях лейкемии человека (Medyouf and Ghysdael, 2008).Ингибирование сигнального пути NFAT в лейкозных клетках вызвало остановку роста клеток и индукцию апоптоза in vitro и in vivo (Mancini and Toker, 2009). Из-за важности передачи сигналов NFAT в прогрессировании лейкемии и наших результатов анализа мотивов связывания промотора мы дополнительно исследовали влияние никлозамида на передачу сигналов NFAT с использованием репортерной линии клеток. Мы впервые обнаружили, что никлозамид значительно ингибирует передачу сигналов NFAT дозозависимым образом.Следовательно, ингибирование активности NFAT может приводить к остановке роста и индукции апоптоза, участвуя в противораковой активности никлозамида.

Мы пришли к выводу, что никлозамид обладает большим потенциалом в качестве противоракового агента. В этом исследовании никлозамид показал отличную активность против лейкемии с множественной лекарственной устойчивостью. Таким образом, никлозамид может решить проблему МЛУ у онкологических больных. Результаты настоящего исследования показывают, что цитотоксическая активность никлозамида обусловлена ​​его воздействием на несколько сигнальных путей в раковых клетках.Мы идентифицировали ингибирование синтеза GSH и передачи сигналов NFAT как новые механизмы противораковой активности никлозамида. Анализ данных микроматрицы показал, что клеточный ответ ракового типа можно предсказать по профилю экспрессии его гена. Эти данные также предполагают участие липидного метаболизма в противораковой активности никлозамида. Поэтому разумно рассматривать никлозамид в качестве клинического кандидата для лечения рефрактерных форм рака с множественной лекарственной устойчивостью.

Авторские взносы

SH выполнил анализ цитотоксичности, активных форм кислорода, глутатиона и репортера NFAT, анализ мотивов связывания промотора и написал статью.PJ выполнил анализ микрочипов и молекулярный докинг. TE руководила проектом и написала статью.

Финансирование

Авторы выражают благодарность за д.э.н. стипендия Германской службы академических обменов (DAAD) SH.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00110/full#supplementary-material

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сокращения

ABC, АТФ-связывающая кассета; GS, глутатионсинтетаза; GSH, глутатион; МЛУ, множественная лекарственная устойчивость; NFAT, ядерный фактор активированных Т-клеток; Pgp, P-гликопротеин; АФК, активные формы кислорода.

Сноски

1. http://www.chemspider.com
2. https://cpi.bio-x.cn/drar
3. http://www.rcsb.org/pdb
4. https://dtp.cancer.gov
5. http: // cistrome.org

Список литературы

Аллен, Дж. Д., Бринкхейс, Р. Ф., ван Деемтер, Л., Вейнхолдс, Дж., И Шинкель, А. Х. (2000). Обширный вклад переносчиков множества лекарственных средств P-гликопротеина и Mrp1 в базальную лекарственную устойчивость. Cancer Res. 60, 5761–5766.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Барцевич В. В., Джулиано Р. Л. (2000). Регулирование гена MDR1 репрессорами транскрипции, выбранными с использованием пептидных комбинаторных библиотек. Мол. Pharmacol. 58, 1–10.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Беллами, В. Т. (1996). Р-гликопротеины и множественная лекарственная устойчивость. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 161–183. DOI: 10.1146 / annurev.pa.36.040196.001113

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Capron, A., Capron, M., Dombrowicz, D., and Riveau, G. (2001). Стратегии вакцин против шистосомоза: от концепций до клинических испытаний. Внутр. Arch. Allergy Immunol. 124, 9–15. DOI: 10.1159 / 000053656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Динеску, А., Кундари, Т. Р., Бхансали, В. С., Луо, Дж. Л., и Андерсон, М. Е. (2004). Функция консервативных остатков глутатионсинтетазы человека: значение для ферментов АТФ. J. Biol. Chem. 279, 22412–22421. DOI: 10.1074 / jbc.M401334200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эфферт Т., Фабри У. и Осека Р.(1997). Апоптоз и устойчивость к даунорубицину лейкозных клеток человека. Лейкемия 11, 1180–1186. DOI: 10.1038 / sj.leu.2400669

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fonseca, B.D., Diering, G.H., Bidinosti, M.A., Dalal, K., Alain, T., Balgi, A.D., et al. (2012). Анализ структуры-активности никлозамида показывает потенциальную роль рН цитоплазмы в контроле млекопитающих, являющихся мишенью для передачи сигналов комплекса 1 рапамицина (mTORC1). J. Biol. Chem. 287, 17530–17545.DOI: 10.1074 / jbc.M112.359638

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харвальдт П., Ральфс С. и Беккер К. (2002). Глутатион S-трансфераза малярийного паразита Plasmodium falciparum: характеристика потенциальной мишени для лекарственного средства. Biol. Chem. 383, 821–830. DOI: 10.1515 / bc.2002.086

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hoelder, S., Clarke, P.A., and Workman, P. (2012). Открытие низкомолекулярных противораковых препаратов: успехи, проблемы и возможности. Мол. Онкол. 6, 155–176. DOI: 10.1016 / j.molonc.2012.02.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Housman, G., Byler, S., Heerboth, S., Lapinska, K., Longacre, M., Snyder, N., et al. (2014). Лекарственная устойчивость при раке: обзор. Раков 6, 1769–1792. DOI: 10.3390 / Cancers6031769

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ичидзё, Х., Нисида, Э., Ирие, К., тен Дийке, П., Сайто, М., Моригути, Т., и другие. (1997). Индукция апоптоза с помощью ASK1, MAPKKK млекопитающих, который активирует сигнальные пути SAPK / JNK и p38. Наука 275, 90–94. DOI: 10.1126 / science.275.5296.90

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иванова Д., Бакалова Р., Лазарова Д., Гаджева В., Желев З. (2013). Влияние активных форм кислорода на противораковые терапевтические стратегии. Adv. Clin. Exp. Med. 22, 899–908.

Google Scholar

Избицка, Е., Лоуренс, Р., Черна, К., Фон Хофф, Д. Д., и Сандерсон, П. Э. (1997). Активность TER286 против колониеобразующих единиц опухоли человека. Anticancer. Наркотики 8, 345–348. DOI: 10.1097 / 00001813-199704000-00006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jin, Y., Lu, Z., Ding, K., Li, J., Du, X., Chen, C., et al. (2010). Противоопухолевые механизмы никлозамида в стволовых клетках острого миелогенного лейкоза: инактивация пути NF-kappaB и генерация активных форм кислорода. Cancer Res. 70, 2516–2527. DOI: 10.1158 / 0008-5472.can-093950

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С. Л., Сон, А. Р., Ан, Дж., И Сонг, Дж. Й. (2014). Никлозамид усиливает гибель клеток, опосредованную ROS, за счет активации c-Jun. Биомед. Фармакотер. 68, 619–624. DOI: 10.1016 / j.biopha.2014.03.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Ю., Ли, П. К., Робертс, М. Дж., Аренд, Р. К., Самант, Р. С., Бухсбаум, Д. Дж. (2014). Мульти-таргетная терапия рака никлозамидом: новое применение старого препарата. Cancer Lett. 349, 8–14. DOI: 10.1016 / j.canlet.2014.04.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Liao, Z., Nan, G., Yan, Z., Zeng, L., Deng, Y., Ye, J., et al. (2015). Антигельминтный препарат никлозамид подавляет пролиферативную активность клеток остеосаркомы человека, воздействуя на несколько сигнальных путей. Curr.Раковый препарат. Targets 15, 726–738. DOI: 10.2174 / 156800961566615062

57

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Т., Ортиз Дж. А., Тайнг Л., Мейер К. А., Ли Б., Чжан Ю. и др. (2011). Цистром: интегративная платформа для исследований регуляции транскрипции. Genome Biol. 12: R83. DOI: 10.1186 / GB-2011-12-8-r83

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Medyouf, H., и Ghysdael, J.(2008). Путь передачи сигналов кальциневрин / NFAT: новая терапевтическая мишень при лейкемии и солидных опухолях. Cell Cycle 7, 297–303. DOI: 10.4161 / cc.7.3.5357

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мэн, X. Y., Zhang, H. X., Mezei, M., and Cui, M. (2011). Молекулярный докинг: мощный подход к открытию лекарств на основе структуры. Curr. Comput. Aided Drug Des. 7, 146–157. DOI: 10.2174 / 1573405677602

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мори, С., Нада, С., Кимура, Х., Таджима, С., Такахаши, Ю., Китамура, А., и др. (2014). Путь mTOR контролирует пролиферацию клеток, регулируя фактор транскрипции FoxO3a через киназу SGK1. PLoS ONE 9: e88891. DOI: 10.1371 / journal.pone.0088891

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паулл К. Д., Шумейкер Р. Х., Ходес Л., Монкс А., Скудьеро Д. А., Рубинштейн Л. и др. (1989). Отображение и анализ паттернов дифференциальной активности препаратов против линий опухолевых клеток человека: построение среднего графика и алгоритм СРАВНЕНИЯ. J. Natl. Cancer Inst. 81, 1088–1092. DOI: 10.1093 / jnci / 81.14.1088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Полехина Г., Борд П. Г., Гали Р. Р., Россджон Дж. И Паркер М. В. (1999). Молекулярная основа дефицита глутатион-синтетазы и редкое событие перестановки генов. EMBO J. 18, 3204–3213. DOI: 10.1093 / emboj / 18.12.3204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шерф У., Росс Д.Т., Уолтем, М., Смит, Л. Х., Ли, Дж. К., Танабе, Л. и др. (2000). База данных экспрессии генов для молекулярной фармакологии рака. Нац. Genet. 24, 236–244. DOI: 10.1038 / 73439

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сео, Э. Дж., И Эфферт, Т. (2016). Взаимодействие антигистаминных препаратов с трансляционно-контролируемым опухолевым белком человека (TCTP) как новый подход к дифференцированной терапии. Oncotarget 7, 16818–16839. DOI: 10.18632 / oncotarget.7605

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх С., Хан А. Р. и Гупта А. К. (2012). Роль глутатиона в патофизиологии рака и терапевтических вмешательствах. J. Exp. Ther. Онкол. 9, 303–316.

Google Scholar

Стонтон, Дж. Э., Слоним, Д. К., Коллер, Х. А., Тамайо, П., Анджело, М. Дж., Парк, Дж. И др. (2001). Прогнозирование химиочувствительности с помощью транскрипционного профилирования. Proc. Natl. Акад.Sci. США 98, 10787–10792. DOI: 10.1073 / pnas.1

598

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тада, Ю., Брена, Р. М., Хакансон, Б., Моррисон, К., Оттерсон, Г. А., и Пласс, К. (2006). Эпигенетическая модуляция альфа-активности супрессора опухолей CCAAT / энхансера при раке легких. J. Natl. Cancer Inst. 98, 396–406. DOI: 10.1093 / jnci / djj093

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вартенберг, М., Hoffmann, E., Schwindt, H., Grunheck, F., Petros, J., Arnold, J. R., et al. (2005). Связанная с реактивными формами кислорода регуляция транспортера множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в сфероидах опухоли предстательной железы, сверхэкспрессирующей Nox-1. FEBS Lett. 579, 4541–4549. DOI: 10.1016 / j.febslet.2005.06.078

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wosikowski, K., Schuurhuis, D., Johnson, K., Paull, K. D., Myers, T. G., Weinstein, J. N., et al. (1997). Идентификация рецепторов эпидермального фактора роста и ингибиторов пути c-erbB2 путем корреляции с паттернами экспрессии генов. J. Natl. Cancer Inst. 89, 1505–1515. DOI: 10.1093 / jnci / 89.20.1505

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yu, J. S.